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基于人工小rna的多基因调控系统的构建及解析

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基于人工小RNA的多基因调控系统的构建及解析

作者：张芬芳天津大学

学位级别：硕士

细菌小rna是一类长度在50～300 bp且通常不具备翻译能力的功能分子,在环境胁迫响应、代谢变化适应和细菌毒力控制过程中发挥着不可替代的调控作用。近年来,基于天然小rna设计构建的人工小rna的工作日益丰富,实现了对目的基因甚至通路的... 详细信息

细菌小rna是一类长度在50～300 bp且通常不具备翻译能力的功能分子,在环境胁迫响应、代谢变化适应和细菌毒力控制过程中发挥着不可替代的调控作用。近年来,基于天然小rna设计构建的人工小rna的工作日益丰富,实现了对目的基因甚至通路的有效调控。人工小rna工具通过与靶m rna进行碱基互补配对而实现转录后调控,其中基于Hfq的人工小rna抑制工具,由结合模块和Scaffold模块组成,对靶基因抑制时只需将结合模块设计成一段24 nt的与靶m rna互补配对的序列,具有设计方便、易于实现、普适性好、抑制效率高等优势,在代谢工程上应用广泛。但在多基因调控方面,面对复杂的细胞网络,经常需要同时对多个基因进行调控,目前常使用多质粒或多启动子策略,但限于相容性质粒的数量或多启动子的重复序列,使小rna应用于多基因调控的数量有限,目前还缺乏一种简单有效、调控范围更广的基于小rna的多基因抑制工具。为此,本文以大肠杆菌MG1655为例,探索并解析了多基因调控的小rna工具。本文完成了以下内容:1、在大肠杆菌MG1655中开发了多种基于Hfq的人工小rna多基因抑制系统,通过比较我们确定了一种新的ZL-s rna多基因抑制系统有较好的同时抑制率和质粒稳定性。该ZL-s rna多基因抑制系统由一个启动子表达多个直接串联的小rna,模块简单,构建方便,并达到了对5个基因平均72.46%的同时抑制率,以及对10个基因平均45.75%的同时抑制率。2、通过体外实验和体内实验初步探究了ZL-s rna多基因抑制系统发挥功能的机制,验证了s rna的Scaffold中Rho因子非依赖性转录终止子的存在使得ZL-s rna多基因抑制系统转录出含不同个数s rna的转录本。这也使得在ZL-s rna中处于不同位置的s rna对其靶基因的抑制效果不同,为实现多基因精细调控提供了研究方向。3、将ZL-s rna多基因抑制系统与光遗传系统结合,初步开发了ZL-s rna多基因光遗传抑制系统,实现光诱导条件下对多基因的抑制,实现了对5个基因达到平均22.79%的同时抑制率。并对影响s rna抑制效果的因素进行分析,对进一步开发高效的光诱导多基因调控工具具有参考价值。本工作开发的基于人工小rna工具的多基因调控系统ZL-s rna具有模块简单稳定、抑制效果好的特点,并从机制上解释了通过改变s rna的位置以实现ZL-s rna用于多基因精细调控的可能。这项工作将为多基因调控工具提供了重要参考。

关键词：大肠杆菌人工小rna 多基因调控必需通路抑制光遗传系统

人工小rna沉默拟南芥植物型PEPC基因的研究

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人工小RNA沉默拟南芥植物型PEPC基因的研究

作者：冯都华浙江师范大学

学位级别：硕士

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是一种具有多种生理功能的细胞质酶,广泛分布于高等植物、藻类和多数细菌中。在C4和CAM植物中,PEPC负责光合作用中无机碳的初始同化;C3植物的PEPC在促进TCA循环中间代谢物的回补、协调碳和氮的代谢等方... 详细信息

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是一种具有多种生理功能的细胞质酶,广泛分布于高等植物、藻类和多数细菌中。在C4和CAM植物中,PEPC负责光合作用中无机碳的初始同化;C3植物的PEPC在促进TCA循环中间代谢物的回补、协调碳和氮的代谢等方面有重要作用,被认为是控制C3植物蛋白质与油脂含量比的一个关键酶。同时,PEPC可能与植物对逆境胁迫的响应有密切关系。拟南芥(Arabidopsis thaliana)与油菜(Brassica napus L.)同属十字花科芸薹属,亲缘关系非常近,在编码区,基因平均相似性达85%左右,因此,拟南芥相关的功能基因研究对油菜育种具有重要参考价值。为探索植物型PEPC基因对模式植物拟南芥脂肪酸含量和组分,以及抗逆性等方面的影响,本试验构建了同时沉默拟南芥植物型PEPC基因家族(Atppcl、Atppc2和Atppc3)的人工小rna植物表达载体,用花序浸染法转化拟南芥,成功获得转化植株,并对转化植株进行了相关的分子鉴定和功能分析。主要研究结果如下：1.登录人工小rna设计网站WMD3,提交Atppcl、Atppc2和Atppc3的cDNA序列,设计相应扩增引物,以pRS300质粒为模板(含拟南芥内源miR319a前体骨架),采用重叠PCR的方法克隆了人工小rna的前体片段,连入双元表达载体pFGC5941,构建了沉默Atppc1、Atppc2和Atppc3的人工小rna表达载体pFGC-amiAtppc123,利用花序浸染法转化野生型拟南芥。2.经过除草剂初步筛选,T1代拟南芥幼苗大部分黄化枯死,少数植株正常生长,具有除草剂抗性。提取除草剂抗性苗的叶片DNA进行PCR检测,获得18株T1代转化植株。人工小rna的半定量RT-PCR的分析表明,在转化植株中,人工小rna进行了超量表达。对Atppc1、Atppc2和Atppc3的半定量RT-PCR分析显示：与对照相比较,转化植株Atppc1的表达量显著下调,Atppc2和Atppc3的表达量无明显变化。3.在NaCl胁迫下,对照和转化植株中,Atppcl和Atppc3表现的更为敏感,在盐处理期间,它们的表达水平呈现不同变化趋势,而Atppc2的表达则相对稳定。T2代转化株系种子含油量与对照相比没有明显差异,而脂肪酸组分的测定结果显示,转化株系种子低碳饱和脂肪酸的比例稍高。

关键词：拟南芥植物型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶人工小rna 基因沉默

甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）rna干扰载体的构建及对烟草的遗传转化

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甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）RNA干扰载体的构建及对烟草的遗传转化

作者：王雷河南农业大学

学位级别：硕士

甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)是危害甘薯的主要病毒之一,SPCSV能与多种病毒共侵染甘薯形成协同病害。通过rna干扰(rnai)技术获得转基因植物已经成为防治植物病毒病的行之有效的措施。近年来,又出现了一... 详细信息

甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)是危害甘薯的主要病毒之一,SPCSV能与多种病毒共侵染甘薯形成协同病害。通过rna干扰(rnai)技术获得转基因植物已经成为防治植物病毒病的行之有效的措施。近年来,又出现了一种基于人工小rna(artificial microrna,amirna)干扰技术的抗病毒转基因新策略,该技术具有抗性水平高、稳定性强、安全性高等多种特点。SPCSV编码一个Ⅲ型的rna内切酶(rna endoribonucleaseⅢ,rnase3),推测其为病毒编码的基因沉默抑制子。本项研究拟构建rnase3基因的干扰载体和植物表达载体,利用rnai技术的原理,探索rnase3基因的功能。获得的主要结果如下:(1)以SPCSV西非株系(SPCSV WA)的rnase3基因为目的基因,构建了其植物表达载体和干扰载体。将rnase3基因以反向重复的方式克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧,再将含有内含子的反向重复片段插入到中间载体pROK219上,最后将“35S启动子-反向重复片段-NOS终止子”的片段克隆到植物表达载体pBin19上,成功构建了SPCSV rnase3基因的hprna干扰载体p Bin19 Ri。(2)同时,将rnase3完整基因克隆至pROK219上,再将含“35S启动子-rnase3-NOS终止子”的片段克隆至pBin19上,成功构建了SPCSV rnase3基因的植物表达载体p Bin19 R3。(3)利用WMD3平台设计并筛选ami rna,通过改造拟南芥前体mi R159a为pre-amiR159a-R3,使之可以表达靶向rnase3的amirna,人工合成该基因并克隆至载体PBI121上,成功构建了rnase3基因的ami rna干扰载体PBI121 amiR。(4)以上载体经冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导的叶盘转化法,将载体转入普通烟草K326中。目前已经获得部分再生植株,其中转化表达载体p Bin19的烟草14株,转化发卡rna(hairpin rna,hprna)干扰载体p Bin19 Ri的烟草14株,转化ami rna干扰载体PBI121 ami R的烟草18株。

关键词：甘薯褪绿矮化病毒 rna干扰人工小rna 载体构建抗病毒转基因植物

定向诱导Dicer酶切割目标双链rna方法的研究

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定向诱导Dicer酶切割目标双链RNA方法的研究

作者：许文中山大学

学位级别：硕士

反义技术(Antisense technology)是指反义DNA或者rna以序列特异性的方式抑制基因表达的技术,其已在基因功能解析、靶标确定和疾病治疗等方面得到了广泛运用。迄今,人们运用的反义技术主要有3种:反义寡聚核苷酸(Antisense oligonucleotid... 详细信息

反义技术(Antisense technology)是指反义DNA或者rna以序列特异性的方式抑制基因表达的技术,其已在基因功能解析、靶标确定和疾病治疗等方面得到了广泛运用。迄今,人们运用的反义技术主要有3种:反义寡聚核苷酸(Antisense oligonucleotides,AS-ONs)、核酶(Ribozyme,Rz)与脱氧核酶(Deoxyribozyme,DRz)以及rna干扰(rna interference,rnai)。AS-ONs与其互补配对的rna结合,通过激活核酸内切酶活性或者空间位阻的方式阻止靶基因的表达;而核酶和脱氧核酶是本身具有催化活性的寡聚核苷酸,即它们与靶序列特异性结合后,直接剪切靶序列。作为第三种高效的反义技术,rnai技术是用21-23个核苷酸的小干扰rna(Small interfering rna,sirna)分子来实现靶基因表达的抑制。本研究设计一种新的反义技术,即利用一段和Dicer酶高效亲和的寡聚核苷酸—Oligomer rna来定向诱导Dicer酶切割目标双链rna,从而达到抑制基因表达的目的,我们将这种技术命名为DICERi技术。本研究将Oligomer rna和靶序列的反义rna相连所形成的rna称为人工小rna(Artificial small rna,asrna),asrna既具有特异性结合靶rna的特性,又具有定向诱导Dicer酶的特性。首先,选取人宫颈癌细胞株Hela细胞和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞为实验细胞,选取与肿瘤发生和发展相关的肺腺癌转移相关因子MALAT-1基因为靶标,构建能够转录相应asrna的质粒后,将其导入实验细胞中,从相对表达水平以及细胞增殖、迁移和凋亡等方面检验此新技术的合理性与可行性。接着,为了证实抑制效应的发生确实是由Dicer酶引起的,我们向实验细胞中同时导入转录敲低Dicer基因表达的shrna和asrna的质粒后,再次检测MALAT-1基因的相对表达水平;最后,在黑头呆鱼上皮癌细胞EPC细胞中,导入靶向原癌基因c-MYC mrna的asrna后,检测c-MYC的相对表达水平和EPC细胞增殖、迁移和凋亡等方面的变化。主要研究结果如下:1.Hela细胞和MDA-MB-231细胞中导入转录靶向MALAT-1的asrna质粒后,实时荧光定量PCR反应结果显示,Hela细胞和MDA-MB-231细胞中MALAT-1的相对表达水平显著降低;CCK-8实验和EdU实验结果表明,Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力明显下降;划痕实验和Transwell实验结果显示,Hela细胞和MDA-MB-231细胞的迁移能力明显被抑制;ELISA实验和Hoechst染色实验结果显示,Hela细胞和MDA-MB-231细胞的凋亡数目明显增多。2.Hela细胞和MDA-MB-231细胞中同时导入敲低Dicer基因表达的shrna质粒和靶向MALAT-1的asrna质粒后,实时荧光定量PCR实验结果显示,敲低Hela细胞和MDA-MB-231细胞中Dicer基因的表达后,靶标MALAT-1的表达没有发生明显变化。3.向EPC细胞中导入靶向c-Myc mrna的as rna质粒后,发现c-Myc的相对表达水平和EPC细胞增殖、迁移等能力都明显降低;凋亡数目显著增加,这些实验结果和在Hela细胞和MDA-MB-231细胞中得到的结果相同。

关键词：反义技术人工小rna Dicer酶抑制基因表达

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拟南芥mirna及其靶序列配对特征分析

中国农业科技导报 2009年第4期11卷 53-57页

作者：刘冲孙杰范云六王磊石河子大学农学院绿洲生态实验室新疆832003 中国农业科学院生物技术研究所国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程北京100081

micrornas（mirnas）是真核生物中一类长度约为22 nt的非编码小分子rna,mirna与AGO等蛋白形成RISC沉默复合体,通过剪切或翻译抑制对靶基因起负调控作用。对拟南芥mirna序列及其配对的靶序列间的特征进行了统计分析,结果表明mirna序列5... 详细信息

micrornas（mirnas）是真核生物中一类长度约为22 nt的非编码小分子rna,mirna与AGO等蛋白形成RISC沉默复合体,通过剪切或翻译抑制对靶基因起负调控作用。对拟南芥mirna序列及其配对的靶序列间的特征进行了统计分析,结果表明mirna序列5′端富含A、U,第1、第19碱基位对U、C具有较强的倾向性;mirna与靶序列间常有1～4个碱基错配,错配碱基常出现在第1,第2和第21位,而第3～第6,第9～第10,第16～第17碱基配对较为保守,为人工合成mirna的设计及mirna靶基因的预测以提供了依据。

关键词：拟南芥基因沉默 rnai 微小rna 人工小rna