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25-羟基维生素D_3人工完全抗原的合成与鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第11期27卷 1173-1175,1179页

作者：万巍巍张换敬叶辉铭万丽琴蔡良良郑立谋曾骥孟厦门大学生物医学研究院转化医学中心福建厦门361005 南昌大学第一附属医院普三科江西南昌330006

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀... 详细信息

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA和25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-OVA。通过紫外吸收光谱,SDS-PAGE和MALDI-TOF进行偶联鉴定。用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫小鼠,获得抗25-羟基维生素D3抗体免疫血清。结果:25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯与BSA的偶联比为(12±0.16)∶1,免疫小鼠后获得高效价(效价为6.25×10-4)的抗体,且标准品浓度在37.5～600 ng/mL范围具有显著的竞争性线性关系,检测的灵敏度为37.5 ng/mL。结论:成功合成了25-羟基维生素D3人工完全抗原,制备出25-羟基维生素D3的抗体且其线性关系显著,灵敏度较高,为进一步研制检测25-羟基维生素D3的试剂盒奠定了基础。

关键词： 25-羟基维生素D3 半抗原-[C-3]-载体蛋白偶联人工完全抗原

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微囊藻毒素人工完全抗原制备与鉴定

黑龙江畜牧兽医 2017年第5期 1-4页

作者：高阳林超郭一平王菡潘悦聂红霞任洪林胡盼李岩松周玉柳曾善卢士英吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病教育部重点实验室长春130062 大连众信检测技术有限公司辽宁大连116045

为了研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)的免疫学检测方法,试验制备了MC-LR人工完全抗原,采用水溶性碳二亚胺法将微囊藻毒素的羧基与牛血清白蛋白(BSA)的氨基偶联,同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描分析及ELISA等技术... 详细信息

为了研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)的免疫学检测方法,试验制备了MC-LR人工完全抗原,采用水溶性碳二亚胺法将微囊藻毒素的羧基与牛血清白蛋白(BSA)的氨基偶联,同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描分析及ELISA等技术对偶联结果进行鉴定与分析。结果表明:微囊藻毒素的羧基与BSA的氨基偶联成功。说明人工完全抗原制备成功,可用于MCLR的免疫学检测。

关键词：微囊藻毒素(MCs) 碳二亚胺法偶联人工完全抗原免疫学检测

半抗原直接包被的磺胺二甲氧嘧啶酶联免疫吸附分析法的建立

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食品科技 2023年第3期48卷 303-309页

作者：张玉超周洪波刘良禹朱思洁刘旭东茅台学院酿酒工程系贵州仁怀564507 茅台学院食品科学与工程系贵州仁怀564507 中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266071 贵州特色食品开发及综合利用工程研究中心贵州仁怀564507

作为食品中抗生素残留的主要类型之一,传统的磺胺类抗生素(Sulfonamides,SAs)酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)常以多克隆抗体和完全抗原包被作为检测基础,可能会出现检测灵敏度低、标准化难等问题。为建... 详细信息

作为食品中抗生素残留的主要类型之一,传统的磺胺类抗生素(Sulfonamides,SAs)酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)常以多克隆抗体和完全抗原包被作为检测基础,可能会出现检测灵敏度低、标准化难等问题。为建立更优的SAs ELISA检测方法,以磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)为研究对象,并将其作为半抗原与大分子蛋白质偶联制备人工完全抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗SDM的单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)。并采用酸性高锰酸钾羧化酶标板,将SDM直接包被在酶标板上后对ELISA反应体系条件进行优化,构建一种基于MAb的半抗原直接包被的SDM间接竞争ELISA(Indirect competitive ELISA,icELISA)检测方法。所制备的MAb特异性良好,交叉反应率低。所构建的icELISA检测法检测条件为:半抗原包被浓度为0.5μg/mL,抗体稀释比为256000,竞争反应体系温度为25℃,pH7.4,以1%BSA溶液作为封闭剂。该方法最低检测限IC_(10)为0.274 ng/mL,半数抑制率IC50为8.39 ng/mL,水和牛乳中加标回收率分别为97.28%~101.2%、98.34%~101.28%。与同等条件下建立的人工抗原包被的icELISA检测方法(IC_(10):0.579 ng/mL,IC50:22.5 ng/mL,水和牛乳中加标回收率分别为92.08%~105.22%、94.62%~103.76%)相比检测灵敏度有明显提高,并可用于实际样品中SDM含量的检测,具有良好的应用前景。

关键词：磺胺二甲氧嘧啶半抗原包被人工完全抗原单克隆抗体酶联免疫吸附分析法

洛克沙胂完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

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洛克沙胂完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

作者：王奇奇郑州大学

学位级别：硕士

洛克沙胂(Roxarsone,ROX)是有机砷制剂的一种,由于它具有抗球虫,促进生长等作用,被广泛应用于畜禽养殖中。但随着科学技术的发展,人们逐渐意识到了ROX带来的不良影响,欧盟、美国、中国都相继禁止ROX的使用或者规定了ROX的最低检测限,因... 详细信息

洛克沙胂(Roxarsone,ROX)是有机砷制剂的一种,由于它具有抗球虫,促进生长等作用,被广泛应用于畜禽养殖中。但随着科学技术的发展,人们逐渐意识到了ROX带来的不良影响,欧盟、美国、中国都相继禁止ROX的使用或者规定了ROX的最低检测限,因此必须建立ROX的快速检测方法。目前检测ROX最常用的方法仍是仪器检测法,包括色谱法和质谱法等,但这些方法需要昂贵的仪器设备,且需专业人员进行操作;而免疫学快速检测方法具有快速,特异,且能大批量检测样品的特点,对ROX的现场快速筛查具有重要的意义。优质的抗体是建立免疫学快速检测方法的关键,目前针对ROX的免疫学快速检测方法主要是以多克隆抗体作为检测抗体,尚未有ROX单克隆抗体检测产品的相关报导。本研究旨在研制出高特异性、高灵敏度的抗体,为建立ROX免疫学快速检测方法打下基础。本研究以ROX的结构类似物3-氨基-4-羟基苯胂酸(HAPA)作为ROX的替代物,用碳二亚胺(EDC)将BSA与HAPA通过酰胺键相连,制备人工合成抗原HAPA-BSA;用戊二醛将OVA与HAPA的伯氨基相连,制备用于检验的包被抗原HAPA-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE鉴定合成的HAPA-BSA和HAPA-OVA,结果证明HAPA与BSA、OVA分别连接成功。用HAPA-BSA免疫3只小鼠,收集四次免疫后血清,测定效价为1:6.4×10,IC值为63.533μg/mL。利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,有限稀释法对阳性细胞亚克隆,筛选出一株可以稳定分泌抗ROX抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G12。收集3G12细胞株培养液,间接ELISA测定效价为1:5.12×10,IC值为3.147μg/mL。随后以腹腔诱生腹水法大量制备单克隆抗体,收集腹水并用辛酸-硫酸铵法纯化,SDS-PAGE结果表明纯化后条带单一;间接ELISA测定纯化前后腹水效价,结果显示纯化前后腹水效价均可达到1:1.024×10,纯化后腹水的IC值为1.433μg/mL。综上所述本研究成功研制得到了抗ROX的单克隆抗体,为建立ROX的免疫学快速检测方法奠定了基础。

关键词：洛克沙胂 3-氨基-4-羟基苯胂酸人工完全抗原单克隆抗体

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异氰酸酯类代表物人工抗原的合成及鉴定

中国卫生检验杂志 2014年第4期24卷 489-492,507页

作者：裴婷婷罗月妙黄钦仪宋宏中山大学公共卫生学院预防医学系广东广州510080

目的合成异氰酸酯类物质二异氰酸甲苯酯(2,4-TDI),二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)及环己烷二异氰酸酯(HDI)的人工完全抗原,为检测环境中异氰酸酯类物质的免疫分析方法的建立奠定基础。方法将不同浓度TDI,MDI,HDI连接到载体蛋白HSA(人血清白... 详细信息

目的合成异氰酸酯类物质二异氰酸甲苯酯(2,4-TDI),二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)及环己烷二异氰酸酯(HDI)的人工完全抗原,为检测环境中异氰酸酯类物质的免疫分析方法的建立奠定基础。方法将不同浓度TDI,MDI,HDI连接到载体蛋白HSA(人血清白蛋白)和OVA(卵清蛋白)上,采用紫外全谱扫描,三硝基苯磺酸法(TNBS)和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)对合成抗原进行鉴定。结果合成的TDI、HDI、MDI完全抗原的紫外吸收光谱、SDS-PAGE电泳条带呈现出与半抗原、载体蛋白不同的吸收峰和条带特性,说明半抗原与载体蛋白偶联成功,TNBS法鉴定结果显示成功合成具有不同偶联比的TDI、HDI、MDI的各3种免疫原和包被原。结论本研究成功合成TDI、MDI、HDI的人工完全抗原,为其免疫测定方法的建立提供了条件。

关键词： TDI MDI HDI 半抗原人工完全抗原

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N-羟乙酰神经氨酸IgY抗体的制备及鉴定

中国畜牧兽医 2016年第3期43卷 629-636页

作者：吴宗澄高阳胡盼李岩松周玉柳增善任洪林卢士英吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室长春130062

本试验旨在建立N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)IgY抗体的制备及鉴定方法。通过碳二亚胺法将Neu5Gc和载体蛋白进行偶联,制备Neu5Gc人工完全抗原,用制备的完全抗原免疫海兰褐蛋鸡制备Neu5Gc-IgY抗体,经ELISA检测分析鉴定抗体活性。经紫外光谱... 详细信息

本试验旨在建立N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)IgY抗体的制备及鉴定方法。通过碳二亚胺法将Neu5Gc和载体蛋白进行偶联,制备Neu5Gc人工完全抗原,用制备的完全抗原免疫海兰褐蛋鸡制备Neu5Gc-IgY抗体,经ELISA检测分析鉴定抗体活性。经紫外光谱扫描、琼脂糖凝胶电泳法初步判断Neu5Gc人工完全抗原制备成功,获得的特异性Neu5Gc-IgY抗体经ELISA检测分析,首次免疫后第7天产生抗体,抗体效价呈动态变化,随着免疫次数的增多,血清效价和抗体效价逐步上升,至初次免疫后63d达到高峰,效价达1∶10 000,停止加强免疫后抗体效价可持续一个月左右,1号鸡产生的IgY抗体具有很好的抗原竞争活性,获得竞争回归方程y=30.28x+16.923,线性系数R2=0.9581。以上结果表明,本试验制备的Neu5Gc IgY抗体取得了理想效果,为红肉、牛奶及肿瘤组织中Neu5Gc的检测奠定了基础。

关键词： N-羟乙酰神经氨酸人工完全抗原蛋鸡 IgY

环境污染物DBP和AFTM1单克隆抗体制备及人体内暴露水平研究

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环境污染物DBP和AFTM1单克隆抗体制备及人体内暴露水平研究

作者：周丽芳浙江大学

学位级别：硕士

随着科技的进步,经济的发展,环境问题越来越凸显。2013年全国肿瘤登记中心对2010年收集到的肿瘤数据进行审核、整理和分析后发现近几年肿瘤疾病的负担日益严重,特别提到与环境相关的健康问题应作为焦点进行跟踪监测。作为导致重要疾病... 详细信息

随着科技的进步,经济的发展,环境问题越来越凸显。2013年全国肿瘤登记中心对2010年收集到的肿瘤数据进行审核、整理和分析后发现近几年肿瘤疾病的负担日益严重,特别提到与环境相关的健康问题应作为焦点进行跟踪监测。作为导致重要疾病的因素之一,环境问题受到越来越多人的关注与重视。之前对环境污染物质检测的研究大多是针对大气、土壤、食物等外环境的监测,这些数据可以间接反映小分子环境污染物的主要暴露来源,从源头控制人类过多的暴露。直接对人体尿样、血样等生物样本中的环境污染物质进行内暴露检测能够客观的反映个体内暴露水平,避免个体差异的影响;更有效的预测、预防特定环境污染物暴露剂量对人体危害;同时可以为环境管理者在研制有害物质及致癌环境卫生学标准、提出环境中有害化学物及致癌物的可接受浓度时提供科学理论依据,进而指导国家卫生部门制定更有效的政策,提高国民的健康状态。目前针对小分子环境污染物的检测方法有仪器分析法和免疫学分析方法两种,传统的仪器分析法(HPLC、GC-MS等)不仅操作复杂,价格昂贵,通量低而且耗时长、灵敏度低,这些缺点限制了其在普通人群中的应用与普及。免疫学的方法采用抗原抗体特异性结合的原理进行检测。目前由于小分子环境污染物质完全抗原的质量低、抗体的特异性差以及方法的灵敏度低、通量低等严重的阻碍了小分子环境污染物质检测技术的发展与应用。本研究在通过细胞融合技术、高强度多次的亚克隆筛选到特异性好、效价高的单克隆抗体的基础上,建立一种灵敏度高、通量高且操作简便的检测方法,使其能够适用于大批量环境污染物邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)和黄曲霉毒素M1 (Aflatoxin M1, AFTM1)内暴露样本的检测。绝大多数小分子环境污染物分子量小,只具有反应原性,而不具有免疫原性,因此针对同一小分子环境污染物需要首先合成2种不同的人工完全抗原作为免疫原和包被原,再选择制备亲和力高的特异性抗体,建立、优化检测方法后,对浙江省普通人群体内的DBP和AFTM1进行检测分析,获得该人群内暴露水平的第一手资料。一.两种小分子环境污染物人工完全抗原的制备与获得小分子环境污染物如邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、黄曲霉毒素M1 (AFTM1),分子量分别为278.34与328,这类物质分子量小、结构简单,必须与载体蛋白结合制备人工完全抗原后才能有效的刺激动物体内产生特异性的抗体。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵血清白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)及多聚赖氨酸(PLL)。偶联臂的应用可以使得半抗原远离大分子载体,避免小分子半抗原被载体大分子遮盖影响其免疫原性,更好的刺激免疫系统。目前应用的连接臂原形有酸酐、碳二亚胺、戊二醛等。根据半抗原的结构基团,分子中含有羧基和可羧化的半抗原可使用混合酸干法与碳二亚胺法,戊二醛法与重氮化法用于含有氨基或者可还原硝基半抗原的小分子偶联,而含有羟基的半抗原可采用琥珀酸酐和羰基二咪唑作为偶联臂。针对DBP小分子环境污染物,该研究选用BSA与OVA作为偶联载体。在4-硝基邻苯二甲酸的基础上,首先创新型的选择催化剂进行酯化合成4-硝基邻苯二甲酸二丁酯,然后选择最优的还原剂还原得到具有氨基结构的4-氨基邻苯二甲酸二丁酯,最后通过重氮化反应偶联蛋白载体获得2种人工完全抗原。DBP-BSA作为免疫小鼠的免疫抗原,DBP-OVA作为建立方法的包被抗原。优化实验条件后,该合成方法较文献中的方法产率提高,合成时间缩短。AFTM1-BSA和AFTM1-OVA的2种小分子环境污染物人工完全抗原则通过购买获得,前者作为免疫抗原,后者作为包被抗原。二.两种小分子环境污染物单克隆抗体的制备与检测方法的建立来自于同一株细胞的单克隆抗体比来自于不同只动物获得的多克隆抗体相比,具有更高的特异性、更好的均一性并且可以体内外大量制备,其来源和产量丰富等优点。因此我们采用经典的细胞融合的方法筛选得到阳性杂交瘤细胞并通过体内培养、体外纯化获得足量的单克隆抗体。继而通过优化包被抗原浓度、抗体浓度与抗体稀释液等多个条件建立最优化的间接竞争ELISA (indirect complete enzyme-linked immunosorbent assay, Ic-ELISA)检测方法。在竞争ELISA的方法中,采用制备得到的DBP-BSA抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后经4次筛选得到杂交瘤阳性细胞株,然后体内大量制备单克隆抗体。在0.25 ug/ml的抗原包被浓度下,采用0.1%明胶稀释液稀释抗体16000倍,该方法灵敏度最高：IC50= 7.34 ng/ml,线性范围为0-50 ng/ml, R2=0.994,最低检测限为0.06 ng/ml,变异系数范围为5.93-11.09%,回收率范围97.8-114.3%。同时与GC-MS传统仪器分析法相关性良好,且较文献中其它各种方法相比,具有更强的特异性、更高的灵敏度

关键词：环境污染物内暴露检测人工完全抗原单克隆抗体

天然除虫菊有效成分的分离及其免疫学检测方法研究

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天然除虫菊有效成分的分离及其免疫学检测方法研究

作者：段伟重庆大学

学位级别：硕士

除虫菊(Chrysanthemum Cineraraeflium)为菊科多年生草本植物,是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。除虫菊的杀虫活性物除虫菊酯(pyrethrins)具有高效、低毒、广谱、低残留等优良杀虫特性,对人、温血动物和环境没有危害,已成为当今... 详细信息

除虫菊(Chrysanthemum Cineraraeflium)为菊科多年生草本植物,是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。除虫菊的杀虫活性物除虫菊酯(pyrethrins)具有高效、低毒、广谱、低残留等优良杀虫特性,对人、温血动物和环境没有危害,已成为当今无公害生物杀虫剂的重要研究热点之一。天然除虫菊酯已广泛应用在农业、林业、生物农药和食品卫生安全等多个领域,因此开发一种简单、快速,适于农药残留现场监控的免疫分析方法具有重要的现实意义。免疫分析法较传统的仪器分析法具有快速、简单、灵敏和选择性高等优点,特别是现场检测的优点,是被列为优先研究、开发和利用的除虫菊酯以及农药残留检测技术。目前,国内外还没有相关的研究与应用报道。建立除虫菊酯免疫学检测方法,首先,必须获得除虫菊酯6种单一有效成分的纯品,但除虫菊酯包括除虫菊酯Ⅰ、Ⅱ,瓜叶菊酯Ⅰ、Ⅱ和茉酮菊酯Ⅰ、Ⅱ6种杀虫有效成分,结构相似,分子量相近,使用一般的分离、提纯方法,获得6种有效成分的高纯度产品(纯度达99%)是很困难的。其次,天然除虫菊酯本身不具有诱导产生抗体的能力,必须设法先将除虫菊酯小分子与载体蛋白质偶联才能制备出人工完全抗原,但除虫菊酯分子中不含有可以直接偶联的基团,需通过衍生过程在除虫菊酯分子内产生活性功能基团或者在其分子结构上通过化学方法引入活性功能基团。在此基础上利用除虫菊酯6种人工完全抗原按一定浓度混合免疫BALB/c小鼠,提取脾脏细胞mRNA并反转录,PCR分别扩增重链及轻链基因库,再通过linker连接,建立除虫菊酯ScFv单链抗体基因库,为筛选除虫菊酯6种单克隆抗体奠定基础。主要研究内容及结果:⑴分离纯化及鉴定天然除虫菊酯6种有效成分,获得6种单一成分的纯品(纯度达99%)。通过优化反相HPLC分离条件,成功分离纯化了天然除虫菊酯六种单一有效成分的纯品,6种成分纯度均达99%。通过GC-MS确证,得到各成分的质谱图,对这些质谱图进行分析,并同谱库中质谱图进行比较,得出每个色谱谱峰对应的结构。第一峰瓜叶菊酯Ⅱ,第二峰除虫菊酯Ⅱ,第三峰茉酮菊酯Ⅱ,第四峰瓜叶菊酯Ⅰ,第五峰除虫菊酯Ⅰ,第六峰茉酮菊酯Ⅰ。⑵首次通过利用反相HPLC半制备柱成功的制备了除虫菊酯六种单一成分的纯品,纯度均达99%,干燥后的成品,最高损失率为30%,最低损失率为2%。1 ml浓度70%的除虫菊酯精油经反相HPLC分离纯化后,可得单一成分固体物达100 mg以上。该方法分离效果好、操作简便,适合大量生产除虫菊酯纯品。⑶根据有机化学原理与除虫菊酯分子的特有结构,制备除虫菊酯6种单一成分的人工完全抗原。以天然除虫菊酯6种有效成分为反应原料,与对-肼苯甲酸在弱酸催化加热回流作用下,分别合成含有羧基的六种活性半抗原除虫菊酯。再利用碳化二亚胺法偶联半抗原与牛血清白蛋白,便可得六种人工完全抗原。分子结合比分别为:除虫菊酯Ⅱ( 1:13),除虫菊酯Ⅰ( 1:6),瓜叶菊酯Ⅱ(1:11),瓜叶菊酯Ⅰ( 1:9),茉酮菊酯Ⅱ(1:9),茉酮菊酯Ⅰ( 1:7)。⑷利用免疫学原理与PCR技术,构建抗除虫菊酯ScFv单链抗体基因库。以天然除虫菊酯6种人工完全抗原按一定浓度混合免疫BALB/c小鼠,ELISA检测血清效价,32 d效价均达105,提取脾细胞的mRNA,反转录,PCR分别扩增重链及轻链可变区基因,并通过linker连接,得抗除虫菊酯ScFv单链可变区抗体基因库。

关键词：除虫菊除虫菊酯分离纯化人工完全抗原 ScFv抗体库

河豚毒素单克隆抗体的制备及其ELISA检测法的建立

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河豚毒素单克隆抗体的制备及其ELISA检测法的建立

作者：刘敏慧天津农学院

学位级别：硕士

动物源性食品安全问题与我们生活密不可分。河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)存在于河豚鱼体内,作为一种天然非蛋白神经毒素,在动物源性食品安全问题中占据了重要地位,对TTX的检测也成为了诸多学者研究的重点。免疫学检测法简便、快速、灵敏... 详细信息

动物源性食品安全问题与我们生活密不可分。河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)存在于河豚鱼体内,作为一种天然非蛋白神经毒素,在动物源性食品安全问题中占据了重要地位,对TTX的检测也成为了诸多学者研究的重点。免疫学检测法简便、快速、灵敏,是近年来常用的检测方法。本研究以初步建立TTX的ELISA检测法为目的进行研究,以期为TTX在动物源性食品中的检测建立一种简便快速的方法。1.本实验使用甲醛作为偶联剂将TTX分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)偶联,获得人工合成抗原。对产物、载体蛋白、半抗原分别使用紫外扫描法及凝胶电泳法进行检测,初步判定偶联抗原合成成功。并通过免疫Balb/c小鼠,检测其鼠尾血清效价,证明所制备的完全人工抗原具有免疫原性,进一步证明人工抗原偶联成功。2.使用常规免疫方案对Balb/c小鼠免疫注射,鼠尾血清抗体效价大于1:4×10;利用细胞融合、ELISA检测等技术筛选单克隆抗体,获得三株可稳定分泌TTX抗体的细胞株A3D6、F10G4、D9F3;使用抑制率最高的A3D6细胞株通过小鼠体内诱生法大量制备单克隆抗体,并进行纯化,SDS-PAGE检测证明纯化后腹水杂蛋白含量明显减少,纯化完全;BCA法检测腹水蛋白浓度为34.84mg/ml,腹水经硫酸铵沉淀、亲和层析纯化后腹水浓度为0.98mg/ml,腹水蛋白回收率为9.51%。抗体亚型检测显示本株单抗亚型为重链IgG,轻链Kappa型。ELISA法检测抗体亲和力结果显示该株抗体亲和力为4.8×10L/mol,抗体亲和力较高。3.利用间接ELISA及间接竞争ELISA技术对纯化后的A3D6单克隆抗体建立TTX的ELISA检测法,经优化后的条件为:包被抗原1:2500倍稀释,37℃包被1h,1%BSA37℃封闭1h,单克隆抗体1:6000稀释,与TTX标准品板外混匀后添加到酶标板中37℃孵育30min,使用1:1×10稀释的二抗37℃孵育30min,TMB显色15min,2M浓硫酸终止,酶标仪读取OD450值。该条件下建立检测法发现在5-200ng/ml时标准曲线线性良好,线性方程为y=0.4071x–r0.1671,R=0.9909,半数抑制率IC50=42.52ng/ml,最低检测限LOD=3.03ng/ml。样品基质干扰检测结果显示当螺肉稀释10倍,贝肉稀释5倍时基本可以去除样品基质的干扰,添加回收试验显示平均加标回收率为90%,平均变异系数为10%。综合以上研究结果,本研究成功制备了人工完全抗原KLH-TTX、BSA-TTX;使用KLH-TTX作为免疫原免疫小鼠能够有效产生抗血清,取脾细胞进行细胞融合后筛选出能够稳定分泌高特异性及高抑制率的TTX单克隆抗体细胞株A3D6;根据该细胞株初步建立了TTX的ELISA检测法,标准曲线线性范围良好,为生产生活中TTX的检测应用打下良好基础。

关键词：河豚毒素(TTX) 人工完全抗原单克隆抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)