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精子发生相关基因的克隆及功能研究

精子发生相关基因的克隆及功能研究

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作者：朱虎南京医科大学

学位级别：硕士

哺乳动物的精子发生是一个极其复杂的过程。在曲精小管中的生精细胞经过漫长的分化过程，最终生成精子。生精过程中发生了许多生物学的变化，如精原细胞的自我更新，精母细胞的减数分裂和精子细胞的变形。精子发生是成年睾丸的一项重要... 详细信息

哺乳动物的精子发生是一个极其复杂的过程。在曲精小管中的生精细胞经过漫长的分化过程，最终生成精子。生精过程中发生了许多生物学的变化，如精原细胞的自我更新，精母细胞的减数分裂和精子细胞的变形。精子发生是成年睾丸的一项重要的功能，许多在睾丸中特异性和／或高度表达的基因参与完成这一过程。为了寻找与精子发生相关的基因，我们采用了两种策略：1．差异显示PCR 分离曲精小管中的DNA含量为2n和4n的细胞群，比较两群细胞的基因表达差异，获取在4n细胞中特异表达的表达序列标签(expressed sequence tags ESTs)。2．人睾丸CDNA微阵列杂交从人睾丸文库中PCR扩增插入片段，将PCR产物点膜制备成cDNA微阵列，然后提取胚胎和成人睾丸的mRNA，制备成探针，分别与微阵列进行杂交，获取差异表达克隆。在第一种策略中，我们从4n细胞中得到6个EST片段，其中有一个EST(R5)与小鼠胞浆内的9-o-乙酰酯酶具有高度同源。人睾丸cDNA文库中筛选后，我们得到该基因的两个不同的转录本，人唾液酸特异的9-o-乙酰酯酶Ⅰ(homo sapiens sialic acid-specific acetylesterase Ⅰ HSEI)和人唾液酸特异的9-o-乙酰酯酶ⅱ(homo sapiens sialic acid-specific acetylesteraseⅡ HSEⅡ)。HSEⅠ cDNA长度为1990bp，在410bp至1876bp间有一个开放阅读框架，编码488个氨基酸。基因序列输入GenBank中，登录号为AF300796。HSEⅡ cDNA长度为2750bp，在13bp至1584bp间有一个开放阅读框架，编码523个氨基酸，GenBank登录号为AF303378。 HSEⅠ和HSEⅡ蛋白质的氨基酸序列基本相同，只是HSEⅡ的N端多出35个氨基酸。通过在GenBank中南京医科大学颀士研究主毕业论义查询，HSEI和 HSEll定位于人N 号染色体长臂的 2区 4带，它们在基困组上的9个外元是一致的，但是HSEI 的前两个外元和 HSEll的第一个外元是不同的。这说明它们是一个基因的两个转录本，使用了不同的转录起始位点。同时很奇怪的是 HSEI的外元但25刁 74b）与 SP（Sperm autoantlgenic protein）基固的一个卜元厂 70J gbp）在基因组上处于同一位置上，只是它们使用了不同的模板链进行基因转录。用高分辨率的TNG 放射杂交试剂盒进行基因染色体定位，结果显示HSE基因是定位于人的＊号染色体上。HSEI和 HSEll组织分布的 Northern blot结果显示膜上共有三条带，其大小分别约为 2，7kb，***和 ***。～2．7kb的条带是HSEll，它广泛地表达于多组织中，其中在睾丸、大肠和前列腺是高表达。***和刁．skb的条带可能是新的HSE基因的转录本。原位杂交结果显示杂交信号位于成人睾丸曲精小管腔的初渊母细胞和精子细胞中，精原细胞、管周细胞和曲精小管外的间质细胞中无任何信号。用 GFP高合蛋白的技术确定HSEI和HSEll 在细胞中勺定位，结果显示HSEI－GFP均匀地分布于细胞浆中，而 HSEll0FP则分布不均匀，在胞浆有聚集成许多荧光信号很强的点。HSEI和HSEH在细胞核部位都没有信号。在第H种策略中，我们共发现有592个克隆在成人睾丸中高表达，表达强度是胚胎睾丸的3倍以上。测序后发现其中共有 317个独立基因，其中有 42个新基因和 90个新6勺睾丸特异6勺转录本（testis－specific transcripts）。我们对其中的一个睾丸特异的转录本一钙激活的中性蛋白酶古制物（testi－specific calpastatin tCAST），和两个新的全长基因一ND七P27和人泛素样融合蛋白山uman ublqultln－like usion protein hwP）进行了进一步研究。人睾丸CDNA微阵列杂交后，tCAST基因的成人睾丸探针杂交信号为 137．5，胚胎睾丸探针杂交信号为 38．02，成人信号是胚胎信号64 3．62倍。tCAST核菩酸－2－南京医科大学硕士研究生毕业论文长度为2290hp，编码590个躺酸，GenB毗的登

关键词：差异显示PCR cDNA微阵列精子生成人唾液酸特异的9-o-乙酰酯酶Ⅰ 人唾液酸特异的9-o-乙酰酯酶ⅱ NYD-SP27 人泛素样融合蛋白

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