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转染HPV16 E5基因对人口腔上皮细胞生物学行为的影响

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转染HPV16 E5基因对人口腔上皮细胞生物学行为的影响

作者：杨文宇安徽医科大学

学位级别：硕士

目的人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是严格的嗜上皮病毒。人是其唯一的宿主。HPV不但和女性宫颈良、恶性肿瘤有直接联系,还常导致口腔粘膜、食道、咽喉、气管和结膜等部位的病变。该病毒的高危亚型还往往和鳞状上皮细胞的... 详细信息

目的人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是严格的嗜上皮病毒。人是其唯一的宿主。HPV不但和女性宫颈良、恶性肿瘤有直接联系,还常导致口腔粘膜、食道、咽喉、气管和结膜等部位的病变。该病毒的高危亚型还往往和鳞状上皮细胞的恶变密切相关。E5一般存在于高危型HPV,在导致良性肿瘤的低危型HPV中经常缺省,这一特点可能和高危型HPV的致癌作用具有潜在联系。目前有关HPV的研究大都围绕HPV的癌基因E6、E7展开,而鲜有针对E5基因的研究报道。本实验构建了E5真核表达载体成功转染人口腔上皮细胞,并对上皮细胞相关生物学特性进行了初步分析,研究结果将为深入研究E5基因功能奠定基础。方法①E5基因的PCR扩增与克隆：通过比较高危型HPV全序列,在E5的上下游保守区设计一对引物(分别含有BamHI，HindⅢ阝艰制性酶切位点),PCR反应,回收纯化产物,获得带有酶切位点的E5基因片段,序列分析;将HPV16 E5连接到质粒pGEM-T,构建质粒pGEM-T-E5,双酶切,测序鉴定。②真核表达载体的构建：设计带有一对酶切位点(HindⅢ, BamHⅠ)的HPV E5引物,分别回收,纯化双酶切下的HPV16 E5 DNA以及真核表达载体pLEGFP-N1l片段,连接回收产物构建成真核表达载体pLEGFP-E5,利用PCR扩增、酶切和测序方法进行鉴定。③利用PA317包装细胞体系包装成逆转录病毒,并感染NIH3T3细胞,确定病毒滴度。④人口腔上皮细胞的原代培养并利用细胞爬片免疫组化法进行鉴定,确定其上皮来源后,利用构建逆转录病毒将HPV16 E5基因转染入人口腔上皮细胞内,并利用PCR、RT-PCR等多种检测方法进行检测确认是否表达。⑤利用MTT法、细胞黏附及伸展试验,研究HPV16 E5基因对人口腔上皮细胞生物学性状的影响。结果①构建含HPV16 E5基因的真核表达载体pLEGFP-E5。酶切和测序鉴定表明,E5被正确插入到载体质粒的多克隆位点内。②将pLEGFP-E5转染PA317包装细胞,获得的逆转录病毒可以转染真核生物细胞。③将HPV16型E5基因转染入人口腔上皮细胞内,经PCR和RT-PCR验证E5基因可以表达,转染后细胞的生物学行为试验表明：HPV16 E5基因可促进人口腔上皮细胞黏附及增殖(P细胞伸展无明显影响(P>0.05) 结论HPV16 E5基因可以提高人口腔上皮细胞细胞活性,促进细胞黏附及增殖,延长其生命周期。

关键词：人乳头状瘤病毒 HPV16 E5基因转染人口腔上皮细胞细胞黏附细胞伸展细胞增殖

单纯疱疹病毒Ⅰ型体外感染人口腔上皮细胞的初步探讨

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单纯疱疹病毒Ⅰ型体外感染人口腔上皮细胞的初步探讨

作者：赵洁南京医科大学

学位级别：硕士

牙周病是人类常见病之一,是成人牙齿丧失的主要原因。牙周炎的发病机制一直是近年来牙周病学领域的研究热点。众所周知,牙菌斑为牙周病的始动因子,它与牙石,食物嵌塞,(牙合)创伤等局部因素和全身因素共同作用引起牙周病。但细菌致病学... 详细信息

牙周病是人类常见病之一,是成人牙齿丧失的主要原因。牙周炎的发病机制一直是近年来牙周病学领域的研究热点。众所周知,牙菌斑为牙周病的始动因子,它与牙石,食物嵌塞,(牙合)创伤等局部因素和全身因素共同作用引起牙周病。但细菌致病学说并不能很好地解释牙周病的部位特异性以及间断爆发性等问题。同时基因检测等分子生物学技术问世和不断发展,许多学者研究发现在牙周炎患者病变位点的龈沟液和牙龈组织中常可检测到疱疹病毒,尤其是单纯疱疹病毒Ⅰ型。因此提出单纯疱疹病毒感染与各型牙周炎具有一定相关关系。单纯疱疹病毒在牙周炎的发生发展中又是通过怎样的途径发挥作用的。考虑到病毒感染宿主的第一步便是病毒吸附进入宿主细胞,而人口腔上皮细胞又是人类口腔中先天性防御系统的第一道屏障,因此在体外建立一个单纯疱疹病毒Ⅰ型感染人口腔上皮细胞的实验模型就具有其特殊的意思。本研究拟在体外大量扩增获得HSV-1,再用标化的病毒直接感染人口腔上皮细胞KB细胞系,建立HSV-1体外感染人口腔上皮细胞模型。并通过间接感染的方法“转移感染”Vero细胞,利用倒置显微镜、透射电镜技术和PCR技术对模型建立结果进行鉴定。实验一HSV-1体外感染人口腔上皮细胞实验模型的建立目的在体外建立HSV-1感染人口腔上皮细胞实验模型,并运用一定方法进行鉴定。材料和方法在体外利用Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)扩增HSV-1,并利用噬斑计数法测定病毒滴度(PFU/ml),用此病毒分别以MOI为0.5PFU/cell、1.0 PFU/cell、3.0 PFU/cell感染人口腔上皮细胞KB细胞,并以正常Vero细胞上清液代替HSV-1病毒液作为空白对照。分别于0h、24h、48h在倒置相差显微镜下观察细胞形态,于感染后48h收集细胞,制成超薄切片在透射电镜下观察超微结构。并用PCR技术检测感染后KB细胞基因组中是否包含HSV-1特异性的糖蛋白D基因片段。结果在体外通过Vero细胞成功的扩增出大量HSV-1,并将其滴定标化为10～6PFU/ml。HSV-1体外感染KB细胞后于24h,48h在倒置显微镜下观察细胞形态,未观察到明显的细胞病变效应。透射电镜下,KB细胞核内及胞浆内均未见HSV-1病毒颗粒。而KB细胞基因组DNA经PCR扩增,凝胶电泳后可见一位于709bp位置的阳性条带,与预测结果一致。结论HSV-1体外感染人口腔上皮KB细胞实验模型建立。KB细胞为HSV-1的非允许性细胞,HSV-1感染KB细胞后可能形成转化性感染或潜伏性感染。实验二KB细胞的上清液对Vero细胞的“转移感染”及鉴定目的通过“转移感染”的间接方法将前述实验中KB细胞的上清液感染对HSV-1敏感的Vero细胞,以此检验HSV-1是否成功感染人口腔上皮KB细胞。材料和方法收集实验一模型中不同MOI组HSV-1体外感染KB细胞48h后的培养上清,并以之感染HSV-1的允许性细胞Vero细胞。分别于0h、24h、48h在倒置相差显微镜下观察细胞形态,于感染后48h收集细胞,制成超薄切片在透射电镜下观察超微结构和病毒形态。并在“转移感染”48h后计算细胞病变率。结果倒置显微镜下,Vero细胞“转移感染”24h时可观察到细胞病变出现;48h时细胞病变率上升。扫描电镜下Vero细胞核内可见大量大小均一的典型HSV-1颗粒。通过对细胞病变率进行统计,得知各滴度组“转移感染”后Vero细胞病变率有显著性差异。结论KB细胞中潜伏的病毒被活化并在Vero细胞中产生了感染性病毒颗粒,证明了HSV-1可在体外感染口腔上皮细胞,并表达其基因。综上所述,本研究利用Vero细胞大量扩增HSV-1,并以此感染人口腔上皮细胞KB细胞,在体外建立HSV-1感染人口腔上皮细胞实验模型。并收集HSV-1感染人口腔上皮细胞后的上清液“转移感染”Vero细胞,通过倒置显微镜,透射电镜超薄切片技术及PCR技术进行检验。结果表明HSV-1能够直接感染口腔上皮KB细胞,形成转化性感染或潜伏性感染,并在KB细胞内表达其基因。

关键词：单纯疱疹病毒I型人口腔上皮细胞透射电镜 PCR

单纯疱疹病毒Ⅰ型体外感染人口腔上皮细胞的实验研究

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口腔医学 2008年第1期28卷 5-8页

作者：赵洁孙卫斌王娟南京医科大学口腔研究所南京医科大学口腔医学院牙周科南京210029

目的研究单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)体外感染人口腔上皮细胞的途径和方式。方法在体外利用非洲绿猴肾细胞大量扩增获得HSV-1,将此病毒体外感染人口腔上皮细胞,建立HSV-1体外感染人口腔上皮细胞模型,并收集HSV-1感染人口腔上皮细胞后的上... 详细信息

目的研究单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)体外感染人口腔上皮细胞的途径和方式。方法在体外利用非洲绿猴肾细胞大量扩增获得HSV-1,将此病毒体外感染人口腔上皮细胞,建立HSV-1体外感染人口腔上皮细胞模型,并收集HSV-1感染人口腔上皮细胞后的上清液转移感染Vero细胞。利用倒置显微镜对病毒感染进行形态学鉴定。应用聚合酶链式反应技术(PCR)对病毒核酸进行检测。结果倒置显微镜下人口腔上皮细胞未观察到典型的细胞病变,上清液转移感染后的Vero细胞发生典型细胞病变。利用PCR法可在单纯疱疹病毒Ⅰ型感染后的人口腔上皮细胞内检测到病毒核酸。结论HSV-1可直接感染人口腔上皮细胞。

关键词：单纯疱疹病毒Ⅰ型人口腔上皮细胞倒置显微镜聚合酶链式反应

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MZB1在牙周炎进程中的作用及机制研究

MZB1在牙周炎进程中的作用及机制研究

作者：李丁一重庆医科大学

学位级别：硕士

目的探讨与牙周炎相关的新型分子MZB1（Marginal Zone B and B-1Cell-Specific Protein）在人牙周膜细胞（h PDLCs）中发挥迁移和对牙槽骨的作用。方法1.在基因表达综合数据库（GEO）中获取人类牙龈组织的基因表达谱,通过生物信息学分... 详细信息

目的探讨与牙周炎相关的新型分子MZB1（Marginal Zone B and B-1Cell-Specific Protein）在人牙周膜细胞（h PDLCs）中发挥迁移和对牙槽骨的作用。方法1.在基因表达综合数据库（GEO）中获取人类牙龈组织的基因表达谱,通过生物信息学分析选择候选分子。通过免疫荧光、RT-q PCR和Western blot检测候选分子MZB1在人牙龈组织、小鼠和人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,h PDLCs）中的定位和表达。2.评估在h PDLCs中分别过表达和敲低MZB1时对h PDLCs的生物学的影响。此外,采用细胞划痕试验、transwell试验、CCK-8试验和流式细胞术检测MZB1对体外细胞迁移、增殖和凋亡的影响。3.通过生物信息学预测和双荧光素酶报告实验评估mi R-185-5p与MZB1的结合。4.通过蛋白免疫印迹方法检测MZB1影响迁移的信号通路。5.通过Micro-CT分析观察MZB1在体内对牙槽骨丢失的影响。结果1.生物信息学分析发现,MZB1基因是牙周炎患者中增加最显著的基因之一。并且,MZB1在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS-PG）处理的h PDLCs,牙周炎患者和牙周炎小鼠牙龈组织中显著升高,与GEO数据库中的芯片结果一致。2.在h PDLCs中过表达MZB1可以抑制h PDLCs迁移,反之,敲低MZB1后,促进h PDLCs的迁移,但细胞的增殖能力及凋亡均未受影响。3.生物信息学和双荧光素酶报告实验证实MZB1是mi R-185-5p的靶基因。4.体外实验表明,MZB1作为mi R-185-5p的靶基因,通过NF-κB信号通路抑制h PDLCs的迁移。牙周膜细胞过表达MZB1后,p-p65表达升高,NF-κB信号通路被激活,相反,沉默MZB1后,p-p65表达降低,NF-κB信号通路受到抑制。过表达MZB1后再加入PDTC（NF-κB抑制剂）,受抑制的细胞迁移能力增强。***1过表达的h PDLCs抑制碱性磷酸酶（ALP）和Runx相关转录因子2（Runx2）m RNA表达水平,敲低反之。此外,体内实验表明,敲除MZB1可以减少牙槽骨的损失。结论MZB1作为mi R-185-5p的靶基因,通过NF-κB信号通路抑制迁移,在牙槽骨丢失中发挥重要作用。目的:探究MZB1在口腔上皮屏障中发挥的作用以及对口腔菌群的影响。方法:通过蛋白免疫印迹,免疫荧光染色检测LPS-PG刺激KB细胞（人口腔上皮癌细胞）后MZB1的表达、定位及相关信号通路的激活。接下来,采用KB细胞建立口腔上皮屏障模型,检测MZB1过表达或敲低后KB细胞的跨膜电阻值（TER）和FITC（异硫氰酸荧光素）-葡聚糖通量的变化评估细胞通透性。WB和IF检测敲低或过表达MZB1对紧密连接蛋白结构、分布和表达的影响。最后,采用siMZB1处理牙周炎小鼠,16s RNA测序分析口腔菌群变化。结果:WB结果显示LPS-PG通过激活NF-κB信号通路上调口腔上皮细胞中MZB1的表达,且MZB1在细胞核中表达。成功构建KB细胞口腔上皮屏障模型后,过表达MZB1降低TER值,而FD4增高,敲低MZB1后则反之。WB和IF证实MZB1过表达会降低紧密连接蛋白的表达并破坏其分布,从而破坏口腔上皮屏障,敲低MZB1则反之。16s RNA测序分析显示,与对照组相比,si-MZB1处理组的小鼠口腔菌群组成发生变化。结论:MZB1破坏牙龈上皮屏障致口腔菌群失衡,在维持口腔上皮屏障功能方面发挥作用。

关键词：牙周炎人牙周膜细胞 MZB1 迁移牙槽骨丢失人口腔上皮细胞口腔菌群

红茶加工过程中化学物质转化及其对尼古丁诱导HOEC损伤的保护作用研究

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红茶加工过程中化学物质转化及其对尼古丁诱导HOEC损伤的保护作用...

作者：赖宛仪浙江大学

学位级别：硕士

尼古丁即烟碱,是一种有害物质,也是诱使吸烟行为发生的主要因素。虽然随着对传统卷烟危害性认识的日渐深入,许多烟民开始选择使用电子烟等替代品满足自身的尼古丁摄取需求,然而,与传统卷烟不同,这些替代品、尤其是电子烟中的尼古丁含量... 详细信息

尼古丁即烟碱,是一种有害物质,也是诱使吸烟行为发生的主要因素。虽然随着对传统卷烟危害性认识的日渐深入,许多烟民开始选择使用电子烟等替代品满足自身的尼古丁摄取需求,然而,与传统卷烟不同,这些替代品、尤其是电子烟中的尼古丁含量很高,可达到传统卷烟的10-100倍。这使得研究尼古丁对健康的影响成为了一个重要课题。同时,大量研究表明,口腔癌的发生与吸烟有着紧密联系,鉴于其第16大世界最常发恶性肿瘤之一的地位,加强对口腔健康的研究刻不容缓。实验室早期将一芽二叶的紫娟鲜叶加工为红茶,并根据成品茶叶的香气、滋味及总酚含量进行加工工艺优化,得到了最佳的萎凋时间、发酵时间和发酵温度,分别是14.1h、34.6℃和2.3h。本论文在此基础上研究了红茶加工过程中的非挥发性成分的衍变,同时评价红茶加工过程提取物对尼古丁诱导人口腔上皮细胞（human oral epithelial cell,HOEC）损伤模型的保护作用,进而分析其可能的关键功效成分,为功能型红茶的开发提供参考。主要研究结果如下:（1）对红茶加工过程中的不同阶段样品进行分别取样,包括:鲜叶、萎凋叶、揉捻叶、发酵叶和干燥叶共5个样品。利用UHPLC-Q-TOF/MS技术检测茶叶中的非挥发性成分,共鉴定出98种物质。利用Metaboanalyst对5个过程样品非挥发性成分变化进行两两对比,发现萎凋过程以蛋白质水解生成氨基酸为主导,其中又以comp 62（Phe）增加的最多;在揉捻过程中,最优势的反应是茶黄素的生成,此外,comp 87（Thea）的含量在揉捻中减少;在发酵过程中,除4种黄酮糖苷、3种酚酸、2种生物碱外,其余几乎所有多酚类化合物（包括儿茶素、二聚体儿茶素和大部分的黄酮糖苷）及氨基酸含量均显著下降;在干燥过程中,含量上升的有黄酮糖苷类和酚酸类,下降的主要是氨基酸类和二聚体儿茶素类,且comp 87（Thea）进一步减少,生成了comp 88（茶氨酸葡萄糖苷）。（2）构建了尼古丁损伤HOEC模型,并对细胞增殖、凋亡及周期进行了检测。发现Nicotine组的增殖率降至73.51%,凋亡率升至11.01%,并将细胞周期阻滞在G0/G1期;5组红茶提取物的加入,使得增殖率最高提升至107.01%,凋亡率降至5.26%,并削弱了对G0/G1期的阻滞,恢复了细胞周期。（3）通过对炎症指标的检测,发现尼古丁将HOEC中IL-6和TNF-α含量提升至11.11 pg/m L和34.44 pg/m L,将IL-10含量降低为139.59 pg/m L;5个样品使炎症因子IL-6和TNF-α含量显著降低,抗炎因子IL-10含量显著升高,且以D+Nicotine组为最佳。通过对氧化应激指标的检测,发现Nicotine组中,ROS、MDA各升至138.37%和1.39 nmol/mg prot,5组红茶提取物的处理均能显著降低两个指标,并升高抗氧化酶SOD、CAT、GSH的表达,表现出抗氧化的能力。利用RT-PCR检测了m RNA的表达,验证了Nicotine组中IL-6和TNF-α表达上调,IL-10则下调,W/R/F/D+Nicotine组中IL-6表达均下调,FL/W/F/D+Nicotine组中TNF-α表达下调;抗氧化酶方面,W/D+Nicotine组均显著上调Mn-SOD、SOD1和CAT的表达。（4）利用线性回归分析,发现与红茶提取物促增殖能力变化趋势呈正相关的有TF-3’-G、TF-3-G、Phe和Pro;呈负相关的有EC-（4β→8）-EGCG、TSB、TSF和高脯氨酸;与抗凋亡能力变化趋势呈正相关的有山柰酚3-香豆素糖苷、槲皮素3-芸香苷和Glu;呈负相关的有异牡荆素、牡荆素、4-香豆酰奎宁酸和山柰酚。

关键词：红茶加工尼古丁人口腔上皮细胞