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中国人乳头瘤病毒 6型L1、L2表达及产物自动装配成病毒样颗粒(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第1期35卷 27-34页

作者：王淼王立良陈莲凤韩晔华邹宇宏司静懿宋国兴中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005

为研究我国人乳头瘤病毒 6型 (HPV 6 )基因组晚期区序列变异及衣壳蛋白装配特性 ,从中国尖锐湿疣患者病损组织克隆了HPV 6L1和L2序列 ,经测序、拼接 ,获得HPV 6基因组晚期区序列。获得的两条长 2 86 9bp的序列 (GenBank登录号为AY0 15 0... 详细信息

为研究我国人乳头瘤病毒 6型 (HPV 6 )基因组晚期区序列变异及衣壳蛋白装配特性 ,从中国尖锐湿疣患者病损组织克隆了HPV 6L1和L2序列 ,经测序、拼接 ,获得HPV 6基因组晚期区序列。获得的两条长 2 86 9bp的序列 (GenBank登录号为AY0 15 0 0 6和AY0 15 0 0 8) ,属于HPV 6b亚型 ,与原型序列比较 ,在L1和L2ORF中共有 9个核苷酸变异 ,其中错义突变 4个。将L1和L2分别重组到杆状病毒 (AcNPV)表达载体 ,在Sf9细胞中探讨L1和L2的表达及装配规律。当L1和L2分别表达于Sf9细胞时 ,L1可以在细胞核中装配成病毒样颗粒 (VLP) ,而L2不能。从L1重组杆状病毒单独感染和L1、L2重组杆状病毒同时感染的细胞分别纯化VLP ,获得L1 VLP和L1+L2 VLP。二者在大小及形态上无明显差异 ,直径约 5 0nm ,与真实的病毒粒子相似。L1+L2 VLP包含摩尔比例约为 4∶1的L1和L2 ,具有HPV 6L1VLP构象表位。当用不同比例重组病毒同时感染细胞时 ,一定水平的L2表达可以使L1表达量及VLP产量提高。HPV 6基因组晚期区序列变异率 6分离物中具有代表性。克隆的HPV 6L1和L2序列可以用于表达 ,表达产物 (L1或L1+L2 )可以自发装配成VLP。

关键词：人乳头瘤病毒6型 L1 L2 杆状病毒载体病毒样颗粒

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

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临床皮肤科杂志 2005年第4期34卷 208-210页

作者：党育平王刚范雪莉沈柱樊建勇刘玉峰第四军医大学西京医院皮肤性病科陕西西安710032

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插... 详细信息

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒6型 E7蛋白结核杆菌热休克蛋白70 融合基因原核表达

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人乳头瘤病毒6型L1的克隆表达与纯化

人乳头瘤病毒6型L1的克隆表达与纯化

作者：刘斌西北农林科技大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒6型( human papillomavirus type 6 , HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难。HPV主要衣壳蛋白L1结构比较保守,是主要的种属特异性抗原,可诱生... 详细信息

人乳头瘤病毒6型( human papillomavirus type 6 , HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难。HPV主要衣壳蛋白L1结构比较保守,是主要的种属特异性抗原,可诱生中和性抗体,用于预防HPV的感染。另外,HPV6是引发性疣最常见的病原体,如尖锐湿疣和扁平疣。尖锐湿疣是世界各地高发的性传播疾病。有报道表明,在尖锐湿疣组织中HPV检出率为100%,其中6和11型占90%以上,HPV6与尖锐湿疣有确切的病因关系,为疫苗的应用提供了可能。基于上述的原因,我们对HPV6 L1基因进行了密码子优化,利用原核表达载体pGEX4T-1构建了HPV6 mL1的原核表达载体,IPTG诱导后可见80kD左右的蛋白,对目的蛋白进行了鉴定,并利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B介质对目的蛋白进行了纯化。目的:从质粒pBV105-HPV6扩增获得HPV6 L1片段,将HPV6 L1进行密码子优化。构建HPV6 mL1基因的重组原核表达载体pGEX4T-1/HPV6 mL1,实现HPV6 mL1融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)原核细胞中的表达,摸索目的蛋白的表达及优化条件,并实现目的蛋白的鉴定和纯化。方法:用PCR技术对HPV6 L1基因进行扩增和纯化,并将HPV6 L1基因与克隆载体连接,转化入受体菌,实现目的基因的克隆。将L1基因进行测序,并与GenBank中的序列相比较。根据大肠杆菌偏爱密码子表对L1基因的密码子进行优化,合成优化后的序列。用PCR技术对优化后的HPV6 mL1基因进行扩增和纯化,并将HPV6 mL1基因与克隆载体连接,转化入受体菌,实现目的基因克隆。将测序正确的重组克隆质粒pGEM-T/HPV6 mL1和原核表达载体pGEX4T-1分别进行EcoR I和Sal I的双酶切反应,然后将回收得到的目的基因片段与pGEX4T-1载体大片段,进行定向连接,构建成含目的基因HPV6 mL1的重组原核表达载体。将重组质粒pGEX4T-1/HPV6 mL1转化入BL21(DE3)感受态菌,通过IPTG诱导获得表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。分别对表达菌株在不同浓度的IPTG(终浓度1、0.5、0.1mmol/L)和不同诱导时间(4、8、12、20小时)及不同温度(37℃、25℃、20℃)下进行表达条件的优化。大量制备目的蛋白,经过洗涤,变性和复性后使用GE Healthcare公司的Glutathione Sepharose 4B介质对目的蛋白进行亲和纯化。结果:采用PCR方法,从质粒pBV105-HPV6扩增获得HPV6 L1片段。采用T/A克隆法,实现了HPV6 L1的克隆,测序结果表明克隆基因序列与GenBank中HPV6 L1基因序列同源性为99.9%,有2个碱基发生了突变,但编码的氨基酸不改变。将HPV6 L1基因序列进行了密码子优化,优化后序列与优化前序列相比,基因序列的同源性为75%,但编码的氨基酸没有发生变化。密码子优化后,用密码子偏性分析软件CodonW分析,CAI(Codon Adaptation Index)从0.205提高到0.611,CBI(Codon Bias Index)从-0.117提高到0.531,FOP(Frequency of Optimumcodons)从0.356提高到0.730。成功构建了HPV6 mL1克隆基因的重组原核表达载体pGEX4T-1/HPV6 mL1,并用IPTG诱导实现了HPV6 mL1融合蛋白在BL21(DE3)原核细胞中的表达。HPV6 mL1融合蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体形式最佳表达条件为浓度为1mmol/L IPTG ,温度37℃,诱导4h。经Glutathione Sepharose 4B柱层析纯化得到HPV6 mL1融合蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供基础,是否具有生物活性还有待于进一步研究。

关键词：人乳头瘤病毒6型 L1基因基因优化蛋白表达蛋白纯化

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒的免疫原性分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第2期23卷 81-86页

作者：王淼陈莲凤韩晔华邹宇宏霍淑敏司静懿宋国兴中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005 北京协和医院

目的　研究重组人乳头瘤病毒 6型 (humanpapillomavirustype 6 ,HPV 6 )病毒样颗粒(virus likeparticle ,VLP)的免疫原性。方法　重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的HPV 6L1VLP(L1 VLP)和HPV 6L1+L2VLP(L1+2 VLP)经鉴定后 ,用于免疫BA... 详细信息

目的　研究重组人乳头瘤病毒 6型 (humanpapillomavirustype 6 ,HPV 6 )病毒样颗粒(virus likeparticle ,VLP)的免疫原性。方法　重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的HPV 6L1VLP(L1 VLP)和HPV 6L1+L2VLP(L1+2 VLP)经鉴定后 ,用于免疫BALB/c小鼠 ,对诱导的体液免疫和细胞免疫反应进行了检测。结果　电镜观察显示L1 VLP和L1+2 VLP二者形态上无明显差异 ,为圆形颗粒 ,直径约 5 0nm ,SDS PAGE和Westernblot分析表明 ,L1+2 VLP中L1和L2蛋白摩尔比例为 4∶1。用ELISA法测定免疫小鼠血清抗体滴度 ,加佐剂L1 VLP免疫组和加佐剂L1+2 VLP免疫组血清针对HPV 6L1VLP的滴度在 1∶10 0 0 0以上 ,高于未加佐剂组免疫血清滴度 (1∶2 0 0 0 ) ,L1+2 VLP免疫诱导出了特异于L2抗原的抗体。血清抗体主要识别HPV 6构象依赖性抗原表位 ,与HPV 11抗原显示出一定的交叉反应 ,而与HPV 16无明显交叉反应。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经HPV 6L1VLP再激活后出现了特异性增殖反应 ,3H TdR掺入值与未免疫组之间差异有显著性 (P 0 .0 5 ) ,L1 VLP和L1+2 VLP免疫组刺激指数 (SI)分别为 6 .4和 6 .2 ,阴性对照组SI为 1.1。HPV 6L1VLP再刺激特异地诱导免疫组脾淋巴细胞IL 2和IL 10分?

关键词：人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒免疫原性 HPV 重组杆状病毒尖锐湿疣预防性疫苗

山东省8例尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6型全基因组序列分析

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中国疫苗和免疫 2022年第2期28卷 189-194页

作者：张翠王素婷林小娟纪峰寇增强徐爱强陶泽新宋艳艳山东大学齐鲁医学院公共卫生学院山东济南250012 山东省疾病预防控制中心山东省传染病预防控制重点实验室山东济南250014

目的分析山东省人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)全基因组序列谱系和变异。方法于2019年在山东省3家哨点医院采集尖锐湿疣患者肛门拭子,提取HPV6 DNA进行PCR扩增和测序,对获得的HPV6全基因组序列进行同源性、系统进... 详细信息

目的分析山东省人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)全基因组序列谱系和变异。方法于2019年在山东省3家哨点医院采集尖锐湿疣患者肛门拭子,提取HPV6 DNA进行PCR扩增和测序,对获得的HPV6全基因组序列进行同源性、系统进化和变异分析。结果本研究获得8条HPV6全基因组序列,其中5条属于A谱系,3条属于B1谱系;8条HPV6序列共发生165个核苷酸变异,错义突变率为22.4%(37/165);8条序列的核苷酸同源性为98.48%-99.99%;A谱系和B1谱系的核苷酸变异数分别为109个、56个,错义突变率分别为14.7%(16/109)、37.5%(21/56);两个谱系中E6、E7和E4编码区未发生或极少发生突变。结论山东省尖锐湿疣患者HPV6流行株为A谱系和B1谱系,与全球HPV6流行谱系分布一致;A谱系比B1谱系更保守。

关键词：尖锐湿疣人乳头瘤病毒6型全基因组测序同源性变异

尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒6型L1序列多态性分析

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病毒学报 2002年第2期18卷 102-107页

作者：洪少林王家璧李平川周玲司静懿许雪梅郭秀婵曾毅中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院北京100730 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005

采用PCR方法从协和医院尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒 (HPV) ,并通过限制性片断长度多态性分析分型发现 ,HPV6型为主要感染型别 ,其次是HPV11型。根据临床特征选择主要致病型HPV6 8个分离株 ,扩增L1晚期基因 ,构建重组测序质粒 ,... 详细信息

采用PCR方法从协和医院尖锐湿疣患者皮损中检测人乳头瘤病毒 (HPV) ,并通过限制性片断长度多态性分析分型发现 ,HPV6型为主要感染型别 ,其次是HPV11型。根据临床特征选择主要致病型HPV6 8个分离株 ,扩增L1晚期基因 ,构建重组测序质粒 ,双脱氧法测序并分析L1区的核苷酸和氨基酸序列变异状况。结果表明 ,HPV6L1基因序列发生碱基替换的区域主要有四个区 ,包括SR1(5 911～ 6 10 4 ) ,SR2 (6 2 17～ 6 2 73) ,SR3(6 5 4 0～6 6 6 1)和SR4 (70 6 2～ 72 5 0 )。少数的碱基替换导致错义突变 ,推导的蛋白质一级结构中有 0～ 3个氨基酸发生变异。

关键词：尖锐湿疣病变人乳头瘤病毒6型 L1序列多态性聚合酶链式反应 L1开放读码框基因序列多态性

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒诱导中和抗体

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病毒学报 2003年第1期19卷 11-15页

作者：王淼陈连凤许雪梅王立良陈建国刘士德司静懿宋国兴中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005 协和医院北京100005

为研究重组病毒样颗粒 (virus -likeparticle ,VLP)免疫血清的抗感染作用 ,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒 6型 (humanpapillomavirustype 6 ,HPV - 6 )L1VLP和HPV - 6L1+L2VLP免疫BALB/c小鼠 ,获得抗血清 ,ELISA法... 详细信息

为研究重组病毒样颗粒 (virus -likeparticle ,VLP)免疫血清的抗感染作用 ,用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的人乳头瘤病毒 6型 (humanpapillomavirustype 6 ,HPV - 6 )L1VLP和HPV - 6L1+L2VLP免疫BALB/c小鼠 ,获得抗血清 ,ELISA法测定抗体滴度 ,在细胞水平和裸鼠异源组织移植模型中评价了免疫血清的中和病毒抗感染作用。VLP诱导了高滴度 ( >1∶10 0 0 0 )的血清抗体 ,抗血清可以特异地阻断人胚上皮细胞对VLP的摄入 ,并且能抑制从尖锐湿疣活检标本提取的HPV对人上皮组织的感染。重组HPV - 6VLP免疫小鼠诱导的血清抗体具有中和病毒、抑制感染的作用。提示重组VLP可以用于研制HVP预防性疫苗。

关键词：人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒中和抗体

应用噬菌体展示制备人乳头瘤病毒6型L1蛋白中和性单克隆抗体

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中华实验和临床病毒学杂志 2024年第1期38卷 67-71页

作者：秦薇子陈桂榴张黎中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院) 合肥230001 江苏省疾病预防控制中心南京210009

目的制备人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白特异性单克隆抗体, 探索抗体的结合特点、交叉活性以及中和效果。方法从免疫HPV6 L1蛋白小鼠脾细胞中提取抗体基因, 构建ScFv噬菌体抗体文库。用HPV6 L1蛋白对文库进行富集筛选, 将获得的抗体基... 详细信息

目的制备人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白特异性单克隆抗体, 探索抗体的结合特点、交叉活性以及中和效果。方法从免疫HPV6 L1蛋白小鼠脾细胞中提取抗体基因, 构建ScFv噬菌体抗体文库。用HPV6 L1蛋白对文库进行富集筛选, 将获得的抗体基因表达成鼠IgG后, 验证抗体与L1蛋白的结合性质以及对假病毒的中和效果。结果成功构建了针对HPV6 L1的ScFv抗体文库, 库容量为6.54×10^(7)。抗体文库经HPV6 L1筛选后获得了两株抗体, 命名为Q9和Q11。经ELISA检测, Q9-IgG与HPV6 L1反应的滴度约为10^(6), 与HPV18和45 L1的滴度为10^(2)。Q11-IgG与HPV6 L1结合的滴度约为4×10^(4), 而与其他型别L1均不结合。经过假病毒中和试验测定, Q9-IgG没有中和活性, 而Q11-IgG针对HVP6假病毒的中和滴度约为10^(4).5。结论 Q9和Q11均为HPV6 L1特异性单克隆抗体, 但二者交叉反应性、抗原识别位点及中和活性均具有明显差异。该抗体可为HPV6病毒的基础研究、免疫学诊断以及治疗制剂研发提供工具抗体。

关键词：人乳头瘤病毒6型 L1蛋白噬菌体展示单克隆抗体

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人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

生物技术通讯 2009年第4期20卷 495-497页

作者：刘斌钱永华张骞张万菊张钫麻粉莲郑丽舒西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052

目的:在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型(HPV6)L1的融合蛋白。方法:PCR方法扩增HPV6L1基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6 mL1,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆... 详细信息

目的:在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型(HPV6)L1的融合蛋白。方法:PCR方法扩增HPV6L1基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6 mL1,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果:酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol/L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论:获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。

关键词：人乳头瘤病毒6型 L1基因蛋白表达