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人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

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军事医学科学院院刊 2004年第2期28卷 114-116,122页

作者：庹晓晔徐明达陈璧柴家科盛志勇解放军第304医院烧伤科北京100037 第四军医大学西京医院烧伤科西安711032

目的 :在大肠杆菌系统中表达有活性的人 β 防御素 3(hBD3)。方法 :从pGEM T hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因 ,插入pGEX 4T 1构建pGEX 4T 1 hBD3融合表达载体 ,转化E .coliDH5α宿主菌 ,进行IPTG诱导 ,诱导菌经超声裂解后获... 详细信息

目的 :在大肠杆菌系统中表达有活性的人 β 防御素 3(hBD3)。方法 :从pGEM T hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因 ,插入pGEX 4T 1构建pGEX 4T 1 hBD3融合表达载体 ,转化E .coliDH5α宿主菌 ,进行IPTG诱导 ,诱导菌经超声裂解后获得包涵体 ,包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST hBD3融合蛋白 ,再经凝血酶切割 ,获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果 :以与GST融合表达的方式 ,运用pGEX 4T 1系统在大肠杆菌中表达了hBD3,融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使rhBD3释放出来 ,其对金黄色葡萄球菌的MIC为 4 μg/ml;对大肠杆菌的MIC为 8μg/ml。结论 :采用pGEX 4T 1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。

关键词：人β-防御素3 大肠杆菌融合表达

人β-防御素3融合细菌膜穿透增加蛋白在毕赤酵母中的表达

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第四军医大学学报 2007年第7期28卷 648-650页

作者：庹晓晔柴家科蒋伟常东盛志勇解放军总医院第一附属医院烧伤整形科北京100037 解放军总医院第一附属医院检验科北京100037

目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型... 详细信息

目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆,对阳性克隆进行甲醇诱导表达,上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定.结果:重组载体经酶切和测序证实序列正确,重组X-33-pICZαB-hBD3-BPI克隆经甲醇诱导24h后,上清SDS-PAGE电泳显示有目的蛋白表达,Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性,该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化,蛋白纯度达到89%.结论:采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.

关键词：人β-防御素3 细菌膜穿透增加蛋白融合表达毕赤酵母

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

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人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响

2002年烧伤年会

作者：庹晓晔徐明达陈璧柴家科盛志勇解放军304医院烧伤整形科全军烧伤研究所解放军304医院烧伤整形科全军烧伤研究所解放军304医院烧伤整形科全军烧伤研究所解放军304医院烧伤整形科全军烧伤研究所解放军304医院烧伤整形科全军烧伤研究所

目的研究在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3（hBD3）。方法以构建好的pGEM—T— hBD3重组质粒为模板PCR获得hBD3成熟肽编码区基因,再将其插入到pGEX-4T-1载体的多克隆位点,构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体,转化DH5α宿主菌,进行... 详细信息

目的研究在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3（hBD3）。方法以构建好的pGEM—T— hBD3重组质粒为模板PCR获得hBD3成熟肽编码区基因,再将其插入到pGEX-4T-1载体的多克隆位点,构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体,转化DH5α宿主菌,进行IPTG诱导5h,诱导菌经超声裂解后获得包涵体,包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白,再经凝血酶切割,获得纯化的重组hBD3（rhBD3）。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果以与GST融合表达的方式,运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3, 融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使rhBD3释放出来,其对金黄色葡萄球菌的MIC为 4μg／ml;对大肠杆菌的MIC为8μg／ml。结论采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。

关键词：人β-防御素3 大肠杆菌融合表达

来源： cnki会议评论

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成都医学院学报 2018年第5期13卷 564-567页

作者：李少儒赵淑珍张全华文政芳新乡医学院第一附属医院妇产科新乡453100

目的探究并分析盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响。方法选取2016年9月至2017年9月新乡医学院第一附属医院收治的100例非淋菌性宫颈炎患者,按照随机数字表法分为对照组和试验组,每组50例。对照组患者采用... 详细信息

目的探究并分析盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响。方法选取2016年9月至2017年9月新乡医学院第一附属医院收治的100例非淋菌性宫颈炎患者,按照随机数字表法分为对照组和试验组,每组50例。对照组患者采用交沙霉素治疗,试验组患者采用米诺环素治疗。观察并记录两组患者治疗前、治疗后2周、治疗后4周HBD-1、HBD-2、HBD-3mRNA含量、治疗4周后疗效以及不良反应发生率。结果治疗前后两组患者宫颈组织HBD-2、HBD-3mRNA比较,组别与不同时间点的交互作用有统计学意义(F=10.432,P=0.002),两组患者组间宫颈组织HBD-2、HBD-3 mRNA比较,差异有统计学意义(F=9.126,P=0.003),两组患者宫颈组织HBD-2、HBD-3mRNA不同时间点比较,差异有统计学意义(F=9.726,P=0.003),在治疗4周后试验组宫颈组织HBD-2、HBD-3mRNA明显比对照组低,差异有统计学意义(P素能有效降低非淋菌性宫颈炎患者HBD-2,HBD-3表达,改善其治疗效果,值得临床广泛推广。

关键词：米诺环素非淋菌性宫颈炎人β-防御素3 疗效

HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达

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HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达

作者：彭巍西北农林科技大学

学位级别：硕士

转基因动物乳腺反应器是一种利用转基因技术在动物乳腺中特异性表达多肽药物、疫苗、抗体等蛋白的技术。利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有效率高、成本低廉等优点,并且表达的重组蛋白具有天然生物活性。由于HBD-3在人体正常组织中的... 详细信息

转基因动物乳腺反应器是一种利用转基因技术在动物乳腺中特异性表达多肽药物、疫苗、抗体等蛋白的技术。利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有效率高、成本低廉等优点,并且表达的重组蛋白具有天然生物活性。由于HBD-3在人体正常组织中的含量很少,分离纯化难度较大,通过提取所能获得的HBD-3的量是极其有限的。而化学合成成本太高,耗资巨大,因此通过基因工程技术来获得大量的抗菌肽HBD-3成为首选之路。虽然通过原核表达系统获得的重组HBD-3在抗菌活性、生化特征上与提取的天然HBD-3毫无差异,但以往进行的抗菌肽重组表达研究普遍存在表达量和活性偏低的现象。这可能是因为真核基因在原核细胞中表达时,密码子使用频率不同;也可能是因为在大肠杆菌中表达的产物常以包涵体形式存在,纯化后的蛋白还需要进一步的复性才具有活性。因此,本研究采用奶牛乳腺上皮细胞真核表达系统,通过RT-PCR获得HBD-3 cDNA 45个成熟肽,分离纯化PCR产物,链接到pMD-19载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pMhD ,并对其进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,所克隆的HBD-3基因为210 bp。将HBD-3基因插入到牛β-酪蛋白启动子5’调控区和3’端调控区之间,构成重组质粒pBCD,利用SacI/SacII双酶切质粒pBCD得到3.0kb的BCD基因片段,与经同样双酶切的真核表达载体pEGFP-C1进行定向连接,获得以牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白(Enhancer Green Fluorescent Protein,EGFP)为报告基因的HBD-3基因乳腺表达载体pEBCD。最终将构建成功的表达载体通过脂质体法转染奶牛胎儿成纤维细胞和乳腺上皮细胞,转染24-48 h后,在倒置显微镜下观察转染效率;用G418进行抗性细胞克隆的药物筛选,2周后,提取G418抗性细胞克隆的基因组DNA和细胞总RNA,用PCR和RT-PCR方法检测出阳性转基因细胞克隆,鉴定转基因细胞是否整合到细胞的基因组中,以便最终为通过乳腺生物反应器生产药用蛋白的转基因动物提供核移植供体细胞,然后扩大培养,冻存阳性细胞,为下一步进行核移植提供供体细胞;同时,将构建的表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,筛选阳性克隆进行扩大培养,加入胰岛素,氢化可的松和催乳素进行诱导表达。诱导48 h后,收获上清液,超滤浓缩目的蛋白进行Western blot检测分析。进而证实目的基因HBD-3能够整合到宿主细胞的基因组上,从而使其能以β-酪蛋白为启动子得以到高效表达,利于蛋白的纯化,进而为通过利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白奠定基础。

关键词：人β-防御素3 奶牛β-酪蛋白 EGFP报告基因供体细胞核移植

重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究

同方学位论文库评论

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同方学位论文库

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西南国防医药 2011年第1期21卷 4-7页

作者：周菁陈章田坤吴奎肖贞良成都军区总医院呼吸科成都610083

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对铜绿假单胞菌(PA)形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度(M IC);扫描电镜(SEM)观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果... 详细信息

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对铜绿假单胞菌(PA)形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度(M IC);扫描电镜(SEM)观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果 rhBD-3对PA的M IC值是64μg/m l。rhBD-3作用后8、16、24 h,膜片载体表面PA活菌黏附量减少,且随着rhBD-3浓度的增高,活菌群数量进行性减少;SEM观察见rhBD-3组少量散在的游离细菌,有少量小斑片状多糖复合物,而空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌及多糖复合物交联。结论 rhBD-3可以抑制PA的BF形成,并对早期和成熟期BF具有破坏作用。

关键词：铜绿假单胞菌生物膜人β-防御素3 琼脂糖弥散抗菌法