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作者：何卿玮重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:对本实验小组早期构建的表达人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)的核酸疫苗进行优化。设计并构建表达由人白介素4(human IL-4,hIL-4)和人α-突触核蛋白的多个B细胞表位所组成的融合蛋白的真核表达质粒,并检测所构建核酸... 详细信息

目的:对本实验小组早期构建的表达人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)的核酸疫苗进行优化。设计并构建表达由人白介素4(human IL-4,hIL-4)和人α-突触核蛋白的多个B细胞表位所组成的融合蛋白的真核表达质粒,并检测所构建核酸疫苗的正确性,研究其在哺乳动物COS-7细胞内的表达。方法:选取hα-syn蛋白的三段B细胞表位基因,其间以两个赖氨酸连接,将设计出的基因序列送往公司合成;采用RT-PCR方法从人类淋巴细胞中扩增hIL-4基因后,通过基因重组技术将其与上述合成的基因序列融合,并在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG);随后将融合基因产物克隆到真核表达载体pVAX1上。然后将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α内,抽提质粒,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列。检测合格后采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blot技术检测其表达情况。结果:成功扩增了hIL-4基因,并将其与hα-syn的三段B细胞表位基因融合,并克隆到真核表达载体pVAX1上,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序,表明重组质粒大小、方向和序列完全正确,成功构建了重组质粒pVAX1-IL-4/SYN-B,以此作为核酸疫苗。经转染哺乳动物COS-7细胞株,并在COS-7中得到有效表达,通过Western blot检测具有较好的生物学活性。结论:成功构建核酸疫苗pVAX1-IL-4 /SYN-B,并在哺乳动物COS-7细胞中有效表达。所构建的核酸疫苗具有较好的生物学活性,为研究优化后的核酸疫苗在帕金森病动物模型中的免疫治疗的防治效果奠定了基础。

关键词：人α-突触核蛋白核酸疫苗帕金森病白介素-4

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pVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒的构建及表达

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免疫学杂志 2009年第5期25卷 588-590,595页

作者：何卿玮王加才彭国光王法祥重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市神经病学重点实验室

目的构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达。方法RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位... 详细信息

目的构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达。方法RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位基因融合,在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG)。将融合产物克隆到真核表达载体PVAX1上,利用电泳和测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列。采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blotting技术检测其表达。结果电泳和测序结果与预期一致,并命名为PVAX1-IL-4/SYN-B;质粒转染COS-7细胞株成功,并且能在细胞内高效表达。结论成功构建PVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒,并在哺乳动物COS-7细胞中高效表达,为研究融合质粒在帕金森病动物模型中的免疫效果奠定了基础。

关键词：人α-突触核蛋白融合质粒帕金森病

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α-突触核蛋白A30P突变对小鼠海马齿状回神经发生的影响

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中国兽医学报 2020年第4期40卷 748-753页

作者：蔡宁宁姜禹朱文倩杨蕊张学明吉林大学动物医学学院吉林长春130062

α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)A30P点突变是帕金森病(Parkinson disease,PD)的主要标志之一。已知PD的发生发展与大脑海马齿状回(dentate gyrus,DG)的神经紊乱有密切关系,但尚不清楚该突变对成体DG神经发生有何直接影响。本研究以C5... 详细信息

α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)A30P点突变是帕金森病(Parkinson disease,PD)的主要标志之一。已知PD的发生发展与大脑海马齿状回(dentate gyrus,DG)的神经紊乱有密切关系,但尚不清楚该突变对成体DG神经发生有何直接影响。本研究以C57BL/6正常小鼠(C57BL)、内源性SNCA敲除鼠(SNCA-/-)、SNCA-/-+人SNCA A30P突变基因敲入鼠(A30P SNCA-/-)为实验动物(每组4只),经灌流固定、冰冻切片和免疫荧光组织化学染色,观察分析其DG形态学变化及磷酸化组蛋白3(PH3,增殖标记)、双皮质素(Dcx,神经母细胞标记)、Sox2(干细胞标记)阳性细胞数。结果显示,各组小鼠DG的形态、大小及细胞密度等无明显差异;与C57BL小鼠相比,SNCA-/-和A30P SNCA-/-组小鼠DG中PH3+和Dcx+细胞数量显著减少,而Sox2+细胞数无明显差异。以上结果表明,内源性SNCA的正常表达是DG神经发生所必需的,SNCA-/-和A30P SNCA-/-均能显著减弱或抑制小鼠DG细胞增殖、分化等神经发生活动,但有关其详细分子机制仍需后续进一步研究。

关键词：帕金森病人α-突触核蛋白 A30P点突变神经发生海马齿状回小鼠

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hα-syn蛋白核酸疫苗pVAX1-hαS_(1-140)的构建及其表达

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重庆医学 2008年第17期37卷 1953-1955页

作者：王加才王少君彭国光罗琴江思德王法祥重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市神经病学重点实验室 400016

目的构建含人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)编码基因的真核重组载体,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗开发奠定基础。方法通过PCR方法扩增hα-syn基因的CDS全长片段,含酶切位点KpnⅠ、XbaⅠ和Kozak序列。扩增产物... 详细信息

目的构建含人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)编码基因的真核重组载体,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗开发奠定基础。方法通过PCR方法扩增hα-syn基因的CDS全长片段,含酶切位点KpnⅠ、XbaⅠ和Kozak序列。扩增产物和真核表达载体pVAX1经双酶切、纯化、连接,转化感受态细胞*** TOP10,筛选含目的基因的重组载体pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,用RT-PCR法和Western blot法检测其表达产物。结果经单、双酶切证实插入的基因片段大小一致,基因测序证实其序列和方向完全正确。用RT-PCR法和Western blot法检测表明,重组质粒pVAX1-hαS1-140在COS-7细胞中能表达目的蛋白,而且具有生物活性。结论成功构建了核酸疫苗pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗治疗研究奠定了良好的基础。

关键词：帕金森病人α-突触核蛋白核酸疫苗

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α-突触核蛋白A30P突变影响小鼠海马齿状回神经发生

α-突触核蛋白A30P突变影响小鼠海马齿状回神经发生

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第十六届中国实验动物科学年会

作者：耿琦蔡月花王瑜冯旭蔡宁宁河北医科大学河北省实验动物重点实验室吉林大学动物医学学院

α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA) A30P点突变是帕金森病(Parkinson disease,PD)的主要标志之一。已知PD的发生发展与大脑海马齿状回(Dentate gyrus,DG)的神经发生紊乱有密切关系,但目前尚不清楚该突变对成体DG神经发生有何直接影响。... 详细信息

α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA) A30P点突变是帕金森病(Parkinson disease,PD)的主要标志之一。已知PD的发生发展与大脑海马齿状回(Dentate gyrus,DG)的神经发生紊乱有密切关系,但目前尚不清楚该突变对成体DG神经发生有何直接影响。本研究以C57BL/6正常小鼠(C57BL)、内源性SNCA敲除鼠(SNCA)、SNCA+人SNCA A30P突变基因敲入鼠(A30PSNCA)为实验动物(每组4只),经灌流固定、冰冻切片和免疫荧光组织化学染色,观察分析其DG形态学变化及磷酸化组蛋白3 (PH3,增殖标记)、双皮质素(Dcx,神经母细胞标记)、Sox2 (干细胞标记)阳性细胞数。结果显示,各组小鼠DG的形态、大小及细胞密度等无明显差异;与C57BL小鼠相比,SNCA和A30P SNCA组小鼠DG中PH3和Dcx细胞数量显著减少,而Sox2+细胞数无明显差异。以上结果表明,内源性SNCA的正常表达为DG神经发生所必须,SNCA和A30P SNCA均能显著减弱或抑制小鼠DG细胞增殖、分化等神经发生活动,但有关其详细分子机制仍需后续进一步研究。

关键词：人α-突触核蛋白 A30P点突变神经发生海马齿状回小鼠

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