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人5-脂氧合酶重组蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

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医学理论与实践 2024年第11期37卷 1805-1807,1817页

作者：王晓玲郭明飞史铁伟高丽枫王文涛赤峰学院基础医学院病原生物学与免疫学教研室内蒙古自治区赤峰市024000

目的:原核表达并纯化人5-脂氧合酶(5LO)△112蛋白,将其免疫新西兰大白兔制备5-LO多克隆抗体。方法:使用DNAMAN设计重组引物,PCR扩增N端缺失112个氨基酸的5-LO截短DNA片段,将其重组到KpnⅠ和EcoRⅠ酶切的pET30a(+)质粒中,重组质粒pET30a-... 详细信息

目的:原核表达并纯化人5-脂氧合酶(5LO)△112蛋白,将其免疫新西兰大白兔制备5-LO多克隆抗体。方法:使用DNAMAN设计重组引物,PCR扩增N端缺失112个氨基酸的5-LO截短DNA片段,将其重组到KpnⅠ和EcoRⅠ酶切的pET30a(+)质粒中,重组质粒pET30a-5LO△112转化大肠杆菌Rosetta(DE3),培养至OD_(600)为0.4时加入IPTG以诱导5LO△112重组蛋白表达,目的蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体。结果:使用BugBuster蛋白提取试剂裂解细菌并获得纯度较高的包涵体,包涵体用含6mol/L盐酸胍的溶液变性溶解,再经Ni-NTA agarose亲和纯化得到高纯度的5LO△112重组蛋白。用该蛋白免疫新西兰大白兔获得5-LO的特异性抗体,该抗体的效价为1∶51200。结论:使用6mol/L盐酸胍溶解包涵体蛋白结合Ni-NTA agarose亲和纯化的方法成功获得了纯度较高的5LO△112重组蛋白,并用此蛋白制备了高效价的多克隆抗体。

关键词：人5-脂氧合酶包涵体蛋白亲和纯化多克隆抗体制备

亲和纯化技术联合质谱鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白

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中南大学学报（医学版） 2017年第4期42卷 365-373页

作者：王静张学梅李征李夏雨马健沈守荣中南大学湘雅三医院消化内科长沙410013 中南大学湘雅三医院湖南省非可控性炎症与肿瘤重点实验室长沙410013 中南大学肿瘤研究所长沙410078 中南大学高等研究中心高分辨质谱实验室长沙410078

目的:利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法:构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S... 详细信息

目的:利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法:构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S100A8和p3×Flag-CMV-S100A9,将其转染至HEK293细胞中,48 h后收集蛋白。运用标签分离纯化S100A8和S100A9蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析)归纳分析相互作用蛋白,免疫共沉淀实验鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白。结果:通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出PKM,NPM1,e IF5A等14个与S100A8相互作用的蛋白,鉴定出14-3-3ε,PKM等6个与S100A9相互作用的蛋白。对所鉴定的相互作用蛋白进行生物信息学分析,发现与S100A8和S100A9相互作用的蛋白参与糖代谢、细胞黏附、正向调控NF-κB转录因子活性、抗凋亡等在内的生物信号通路,并利用免疫共沉淀证实PKM2与S100A8和S100A9发生相互作用,14-3-3ε与S100A9发生相互作用。结论:利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选鉴定的S100A8和S100A9相互作用蛋白PKM2和14-3-3ε,可能为阐明S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供重要线索。

关键词：亲和纯化 S100A8 S100A9 相互作用蛋白

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草鱼胰蛋白酶的亲和纯化及酶学性质

食品科学 2021年第10期42卷 178-183页

作者：李晨高柳芳崔晓东韩宇航朱丹旭李娇山西大学生命科学学院山西太原030006 山西大学生物技术研究所山西太原030006

从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆、硫酸铵分级沉淀、透析得到胰蛋白酶粗酶液,通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究该胰蛋白酶的酶学性质。结果表明:草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数K... 详细信息

从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆、硫酸铵分级沉淀、透析得到胰蛋白酶粗酶液,通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究该胰蛋白酶的酶学性质。结果表明:草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数K_(m)为3.4×10^(-5)mol/L;最适反应温度为60℃,在低于60℃条件下稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 6.0~12.0;Ba^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(2+)在0~10 mmol/L范围内对该酶具有一定激活作用,而乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、K^+在0~10 mmol/L范围内对该酶有一定抑制作用,EDTA较K^+对酶的抑制作用更明显。

关键词：草鱼胰蛋白酶亲和纯化酶学性质

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

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生物工程学报 2009年第9期25卷 1409-1416页

作者：王增代茹张江巍陈尚武张文马会勤中国农业大学农学与生物技术学院北京100193 中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成... 详细信息

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。

关键词：拟南芥 WUSCHEL 蛋白质亲和纯化抗体

亲和纯化技术联合质谱分析筛选乳腺癌中p90核糖体S6蛋白激酶4相互作用蛋白

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中国癌症杂志 2016年第7期26卷 581-588页

作者：刘日强刘天华张钦乐江凯郭坤张舒刘银坤杨华伟广西医科大学附属肿瘤医院乳腺外科广西南宁530021 复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032 复旦大学生物医学研究院上海200032

背景与目的:p90核糖体S6蛋白激酶4基因(ribosomal S6 kinase 4 gene,RSK4)作为抑癌基因,能够抑制细胞增殖、迁移并诱导细胞的凋亡,但与其配合发挥相应功能的相互作用蛋白尚不明确。该研究利用Flag标签纯化技术和质谱分析筛选鉴定乳腺癌... 详细信息

背景与目的:p90核糖体S6蛋白激酶4基因(ribosomal S6 kinase 4 gene,RSK4)作为抑癌基因,能够抑制细胞增殖、迁移并诱导细胞的凋亡,但与其配合发挥相应功能的相互作用蛋白尚不明确。该研究利用Flag标签纯化技术和质谱分析筛选鉴定乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的RSK4相互作用蛋白。方法:构建含有RSK4全长和Flag亲和标签的真核表达载体pc DNA3.1/EGFP-RSK4-Flag,将其转染至MDA-MB-231乳腺癌细胞株,72 h后收集细胞蛋白。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)检测RSK4表达情况。运用标签分离纯化RSK4蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定RSK4相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析和IPA分析)归纳分析互作蛋白以及与RSK4相互作用机制。结果:通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38(serine/threonine-protein kinase 38,STK38)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶38类(serine/threonine-protein kinase 38-like,STK38L)、MOB激酶致活因子2(MOB kinase activator2,MOB2)、蛋白精氨酸N甲基转移酶5(protein arginine N-methyltransferase 5,PRMT5)等24个RSK4相互作用蛋白。对所鉴定出的互作蛋白进行生物信息学分析,提示RSK4互作蛋白组参与包含细胞凋亡和细胞迁移运动等在内的多种生物信号通路。结论:利用亲和纯化技术联合质谱鉴定成功筛选出RSK4相互作用蛋白并通过生物信息学分析获得了RSK4参与乳腺癌细胞的凋亡、迁移相关生物调控网络。

关键词：亲和纯化 RSK4蛋白真核表达基因转染

Eglin C与2709碱性蛋白酶相互作用分析及亲和纯化方法

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中国生物化学与分子生物学报 2021年第4期37卷 487-494页

作者：文阳宣周桂旭石亚伟山西大学生物技术研究所教育部化学生物学与分子工程重点实验室太原030006

Eglin C是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。然而,利用eglin C纯化蛋白酶,尚未见研究报道。本文将化学合成的... 详细信息

Eglin C是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。然而,利用eglin C纯化蛋白酶,尚未见研究报道。本文将化学合成的编码eglin C及其突变体的基因序列,克隆到原核表达载体pQE30,在大肠杆菌BL21获得His6-Tag-eglin C及其突变体的重组蛋白质。SDS-PAGE显示,eglin C蛋白的分子量大约8 kD。His6-Tag-eglin C对胰凝乳蛋白酶、地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶的半抑制剂浓度(IC50)分别为0.20±0.15、0.24±0.19、3.33±0.47和52.46±0.38μmol/L。利用分子对接、基因突变以及荧光光谱等,分析eglin C及其突变体与2709蛋白酶的相互作用。结果显示,2709碱性蛋白酶对eglin C荧光淬灭属于静态淬灭,解离常数为2.60×10^(-7)mol/L,eglin C中的Asn50残基对eglin C和2709碱性蛋白酶的结合发挥重要作用。利用eglin C与蛋白酶的特异结合的特性,构建亲和纯化载体,用于纯化来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶,相比常规的蛋白酶纯化,显著简化了操作步骤。

关键词： eglin C 碱性蛋白酶相互作用亲和纯化

3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化及化学修饰提高酶稳定性

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食品与生物技术学报 2016年第7期35卷 747-751页

作者：方亚男段敬霞张玲杨海麟江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

研究了3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶,酶蛋白得率是16.5%,活性回收率为64.7%,纯化倍数约为3.8,15%SDS-PAGE结... 详细信息

研究了3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶,酶蛋白得率是16.5%,活性回收率为64.7%,纯化倍数约为3.8,15%SDS-PAGE结果显示3α-HSD酶为单一条带,相对分子质量在28 000左右。采用邻苯二甲酸酐(PA)作为修饰剂,对3α-HSD纯酶进行化学修饰,与对照组相比,修饰酶抵抗p H波动的能力有所增强,50℃水浴10 min后酶的热稳定性明显提高,37℃贮藏40 h后修饰酶的贮藏稳定性比原酶提高9倍。

关键词： 3α-羟类固醇脱氢酶亲和纯化邻苯二甲酸酐化学修饰稳定性

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亲和纯化重组人白细胞介素-6

食品与生物技术学报 1999年第5期20卷 90-93页

作者：林峰王贺玲甘一如天津大学生物化工系天津300072

研究了利用亲和融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的方法纯化重组人白细胞介素-6(IL-6)的发酵和纯化工艺,使用含有质粒pHZ1818的E.coli JM109在2×YT培养基中进行发酵表达,IL-6表达为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的融合蛋白GST-IL-6。融合蛋... 详细信息

研究了利用亲和融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的方法纯化重组人白细胞介素-6(IL-6)的发酵和纯化工艺,使用含有质粒pHZ1818的E.coli JM109在2×YT培养基中进行发酵表达,IL-6表达为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的融合蛋白GST-IL-6。融合蛋白存在可溶的活性蛋白和不可溶的包含体两种形式,此包含体无活性且无法复性,无法用亲和层析回收,因而通过实验优化了摇床发酵的诱导温度和转速以增加可溶融合蛋白的表达。菌体超声破碎液上清液用亲和柱层析,可将融合蛋白提纯至80%,每升发酵液可得到10 mg融合蛋白,用凝血酶裂解处理6 h,亲和标志物GST被特异性切除,裂解得到的IL-6用离子交换柱层析可纯化至95%,MTT法测得纯化的IL-6生物学活性为1.02×10~8 IU/mg。

关键词：亲和纯化人白细胞介素-6 融合蛋白 GST

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用硝酸纤维素膜亲和法纯化抗体

Acta Botanica Sinica 1997年第6期39卷 534-536页

作者：骆爱玲梁峥 Maurice S B Ku 中国科学院植物研究所北京100093 Botany Department Washington State UniversityUSA

介绍一种改进的纯化抗体方法。将抗原蛋白固定在硝酸纤维素膜上,然后对抗体进行亲和纯化,能快速有效获得高特异性抗体。

关键词：抗体纯化亲和纯化硝酸纤维素膜