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席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

过程工程学报 2024年第4期24卷 480-488页

作者：古嘉如王楠马磊乔娟靳海波何广湘赵岚黄永东张荣月北京石油化工学院新材料与化工学院/燃料清洁化及高效催化减排技术北京市重点实验室北京102617 中国科学院过程工程研究所国家生化工程国家重点实验室北京100190

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点,广泛应用于蛋白分离纯化,本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质,肝素为配基,利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。配基偶联经过三步完成,首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 ... 详细信息

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点,广泛应用于蛋白分离纯化,本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质,肝素为配基,利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。配基偶联经过三步完成,首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 mol/L H_(2)SO_(4)水解为邻羟基,然后将邻羟基氧化为醛基,最后利用醛基与肝素分子的胺基反应将肝素分子固定于微球表面。以溶菌酶为模型蛋白,主要考察了肝素偶联反应的各因素对蛋白结合容量的影响规律,包括肝素浓度、缓冲液pH及浓度、反应时间等,建立了最优偶联肝素配基的方法。所得亲和介质静态结合容量可达40.3 mg/mL,比商品GP-肝素介质高约36%,经1.0 mol/L的氯化钠洗脱,其蛋白回收率达到95%。通过扫描电子显微镜表征微球表面形貌,观察到偶联肝素后的微球仍能保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(31.8~318 cm/h)下的动态结合容量,发现操作流速提高10倍后介质结合容量仅下降12%。经10次重复使用后,动态结合容量仍可保持初始容量的81%。用于混合蛋白模型中分离乳铁蛋白,结果表明具有良好的分离效果。

关键词：亲和层析肝素大孔层析介质偶联方法席夫碱法

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利用5′帽子亲和层析纯化IVT mRNA

科学通报 2024年

作者：杜彬荷林金钟复旦大学mRNA药物研发中心复旦大学遗传工程国家重点实验室

mRNA作为指导蛋白质合成的活性分子,在翻译基础研究和mRNA药物研发中具有广阔的研究价值和应用前景.真核生物细胞质mRNA通常具有区别于其他类型RNA分子的5′端帽结构,在mRNA核转运、抵御核酸外切酶和介导翻译起始过程中发挥重要作用.无... 详细信息

mRNA作为指导蛋白质合成的活性分子,在翻译基础研究和mRNA药物研发中具有广阔的研究价值和应用前景.真核生物细胞质mRNA通常具有区别于其他类型RNA分子的5′端帽结构,在mRNA核转运、抵御核酸外切酶和介导翻译起始过程中发挥重要作用.无帽mRNA分子在机体内引起严重的免疫反应,因此mRNA的加帽率是评判其成药性的核心指标.虽然加帽m RNA可以通过基于T7 RNAP的共转录加帽技术和基于牛痘加帽酶的酶法加帽技术获得,但仍缺乏精确分选加帽m RNA的底盘技术.针对这一现象,本研究选取了覆盖真核生物、古菌、病毒在内的18种帽结合蛋白进行表达纯化测试,并表征了热稳定性、帽结构亲和性等参数.从中筛选获得3种代表性帽结合蛋白进行加帽RNA的亲和层析测试,实验结果表明, Hs IF4E K119A和Ct IF4E可以有效地富集加帽RNA,并且可以通过改变盐浓度的方法实现加帽RNA的洗脱.本研究开发的基于帽结构的亲和层析技术具有成本低、效率高、易于放大的特征,有望为分选加帽m RNA提供新的解决方案.

关键词：帽结构帽结合蛋白亲和层析 mRNA纯化 mRNA药物

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席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

过程工程学报 2023年

作者：古嘉如王楠马磊乔娟靳海波何广湘赵岚黄永东张荣月北京石油化工学院新材料与化工学院/燃料清洁化及高效催化减排技术北京市重点实验室中国科学院过程工程研究所国家生化工程国家重点实验室

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点，而广泛应用于蛋白分离纯化中，本文以大孔聚丙烯酸酯微球为基质，肝素为配基，利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。其配基偶联经过三步完成，首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基... 详细信息

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点，而广泛应用于蛋白分离纯化中，本文以大孔聚丙烯酸酯微球为基质，肝素为配基，利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。其配基偶联经过三步完成，首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 mol/L H2SO4水解为邻羟基，然后将邻羟基进行氧化为醛基，最后利用醛基与肝素分子的胺基反应将肝素分子固定于微球表面。以溶菌酶为模型蛋白，主要考察了肝素偶联反应的各因素对蛋白吸附容量的影响规律，包括肝素浓度、缓冲液pH及浓度、反应时间等，建立了最优偶联肝素配基的方法。所得亲和介质静态吸附容量可达40.3 mg/mL，比商品GP-肝素介质高约36%，经1.0 mol/L的氯化钠洗脱，其蛋白回收率达到95%。通过扫描电子显微镜表征微球表面形貌，观察到偶联肝素后的微球仍能保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(31.8～318 cm/h)下的动态吸附容量，发现操作流速提高10倍后介质吸附容量仅下降12%。经10次重复使用后，动态吸附容量仍可保持初始容量的81%。用于混合蛋白模型中分离乳铁蛋白，结果表明具有良好的分离效果。

关键词：亲和层析肝素大孔层析介质偶联方法席夫碱法

Oligo(dT)亲和层析介质的载量比较和机制分析

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高校化学工程学报 2024年第2期38卷 243-252页

作者：谭远志张鹏程孙艳娜张其磊姚善泾林东强浙江大学生物质化工教育部重点实验室浙江大学化学工程与生物工程学院浙江杭州310058

针对Oligo(d T)亲和层析介质的吸附性能,以poly(A)为模型分子,考察了4种Oligo(d T)亲和层析介质的静态吸附平衡、吸附动力学和动态结合载量(DBC),探讨了载量影响相关机制。结果表明,4种介质的合适吸附条件均为0.6 mol·L-1Na Cl、p H=6~... 详细信息

针对Oligo(d T)亲和层析介质的吸附性能,以poly(A)为模型分子,考察了4种Oligo(d T)亲和层析介质的静态吸附平衡、吸附动力学和动态结合载量(DBC),探讨了载量影响相关机制。结果表明,4种介质的合适吸附条件均为0.6 mol·L-1Na Cl、p H=6~7;Monomix d T20静态吸附容量最大,且poly(A)能扩散至介质微球深层孔内,而Poros Oligo(d T)25、Praesto Jetted (d T)25和Nano Gel d T20等3种介质中poly(A)均主要为表层吸附、静态吸附容量稍低;对于DBC,Nano Gel d T20和Monomix d T20的10%穿透的DBC较高,而Poros Oligo (d T)25和Praesto Jetted (d T)25相对略低。经分析,影响载量的主要因素包含基质种类、微球孔径、配基密度、间隔臂和配基长度等。对于基质种类,聚苯乙烯基质可能孔道结构较为特别。对于微球孔径,应针对不同大小的m RNA分子定制不同孔径的微球,以平衡传质阻力与可及吸附表面积之间的矛盾,从而增大DBC。

关键词：亲和层析 m RNA 寡脱氧胸腺苷酸载量生物分离

重组人干扰素α2b单克隆抗体亲和层析介质的制备及其纯化效果评价

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中国生物制品学杂志 2022年第7期35卷 844-847,852页

作者：顾建阳王宇孙子琪张雯雯常军亮长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130012

目的制备重组人干扰素α2b(recombinant human interferonα2b,rhIFNα2b)单克隆抗体的亲和层析介质,并评价其纯化效果。方法采用小鼠杂交瘤细胞融合技术及小鼠体内诱生法筛选并制备rhIFNα2b单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),经AT... 详细信息

目的制备重组人干扰素α2b(recombinant human interferonα2b,rhIFNα2b)单克隆抗体的亲和层析介质,并评价其纯化效果。方法采用小鼠杂交瘤细胞融合技术及小鼠体内诱生法筛选并制备rhIFNα2b单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),经AT Protein A亲和层析纯化,12%还原型SDS-PAGE鉴定纯度,Western blot法鉴定McAb与rhIFNα2b原液及其聚合蛋白(rhIFNα2b原液于56℃热加速处理)的特异性反应。用筛选的McAb与CNBr-activated Bestarose^(TM) 4FF偶联1~4 h,紫外-可见分光光度法监测偶联液上清McAb蛋白浓度,12%还原型SDS-PAGE验证偶联介质抗体蛋白饱和程度,确定最佳偶联时间。将制备的McAb亲和层析介质装柱后,上样rhIFNα2b原液及经56℃热加速24 h的样品,15%非还原SDS-PAGE验证其纯化效果。结果经杂交瘤制备和筛选,确定以4E2抗体作为偶联McAb,纯度>95%。McAb 4E2与CNBr-activated Bestarose^(TM) 4FF偶联3 h后抗体蛋白浓度趋于平稳,预活化凝胶介质抗体蛋白吸附率约为30 mg/mL,凝胶介质偶联抗体蛋白量趋于饱和,为使偶联更加充分,确定最佳偶联时间为4 h。rhIFNα2b原液及其56℃热加速24 h样品可由McAb亲和柱层析有效吸附洗脱,并保持与McAb的结合活性。结论本实验制备的rhIFNα2b单克隆抗体亲和层析介质,具有良好的纯化效果,为rhIFNα2b不同剂型比对样品的前处理提供了高效方法。

关键词：重组人干扰素α2b 单克隆抗体亲和层析纯化

免疫亲和层析柱纯化大豆球蛋白多克隆抗体的研究

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中国食品学报 2021年第6期21卷 296-300页

作者：姚利利席俊陈慧彬陈阳皮江一李潘河南工业大学粮油食品学院郑州450001

为了得到纯度高、特异性好的抗大豆球蛋白多克隆抗体,用溴化氢活化的琼脂糖4B纯化经硫酸铵分级沉淀后的抗体,此免疫亲和层析过程节省时间且操作简单。经凝胶过滤层析的大豆球蛋白,溶胀后的填料与大豆球蛋白配基以共价键的形式连接,利用... 详细信息

为了得到纯度高、特异性好的抗大豆球蛋白多克隆抗体,用溴化氢活化的琼脂糖4B纯化经硫酸铵分级沉淀后的抗体,此免疫亲和层析过程节省时间且操作简单。经凝胶过滤层析的大豆球蛋白,溶胀后的填料与大豆球蛋白配基以共价键的形式连接,利用抗原抗体特异性结合的特点,杂蛋白随流动相流出,再利用洗脱液将抗大豆球蛋白的目标抗体特异性地洗脱下来,用紫外检测仪检测非特异性洗脱峰和特异性洗脱峰。通过SDS-PAGE鉴定,多抗血清中的其它蛋白组分被非特异性洗脱掉,经浓度测定,特异性洗脱的蛋白质量浓度为0.3 mg/mL,间接ELISA显示,纯化后血清稀释128倍后显示为阳性。间接竞争ELISA测定抗体特异性结果显示抗体特异性得到提高。抗体被成功纯化,为加工破坏大豆球蛋白致敏性亚分子结构定位奠定基础,从而促进低致敏性食品的研发。

关键词：多抗血清亲和层析纯化

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亲和层析法去除牛乳中的过敏原BSA

亲和层析法去除牛乳中的过敏原BSA

连续流层析技术在亲和层析中的应用及生产放大评估

第十二届全国免疫学学术大会

作者：王文杰李欣陈红兵南昌大学食品学院南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌大学中德联合研究院

牛血清白蛋白(BSA)是牛血清中的一种白蛋白。有研究报道,牛乳中存在这牛血清白蛋白,并且被认为牛乳中的过敏原之一。在对牛乳进行过敏原检测过程中,由于牛血清白蛋白的理化性质与酪蛋白等强过敏原类似,从而干扰其它过敏原的检测。由于... 详细信息

牛血清白蛋白(BSA)是牛血清中的一种白蛋白。有研究报道,牛乳中存在这牛血清白蛋白,并且被认为牛乳中的过敏原之一。在对牛乳进行过敏原检测过程中,由于牛血清白蛋白的理化性质与酪蛋白等强过敏原类似,从而干扰其它过敏原的检测。由于同样的原因,难以用等电点沉淀等方法单独除去牛血清白蛋白而不影响其它牛乳过敏原。本文利用亲和层析法建立了一种特异性去除牛乳中BSA的方法。采用的亲和层析的柱材为CNBr-activitiedsephrose-4B 0.5g,在5ml1mM的HCL中溶胀后获得约1.5ml柱材,加入市售GTX30918抗BSA兔源多克隆抗体800ul作为配基与柱材偶联,偶联时,保持抗体与柱材充分混合,每20min测定上清液蛋白浓度,直到浓度恒定偶联结束。然后将凝胶转入封阻液中室温摇动2h封闭未结合位点,最后经过平衡过程获得特异性亲和层析柱。制好的亲和柱经再生、平衡过程后后上样,将样品与柱材混匀,每15min混匀一次,使样品与柱子结合一个小时后洗脱。结果测得偶联率为87.9%,介质密度(偶联的抗体质量/柱材质量)为1.75mg/g。当上样量为0.3mg-0.4mg时,该柱子的柱容量范围在0.23mg左右。通过PBS平衡缓冲溶液和甘氨酸溶液进行非特异性和特异性洗脱,将样品中的BSA去除,BSA的吸附率为76.7%。本方法对牛乳样品的前处理,排除了BSA的干扰具有快速而有效的作用,对牛乳过敏原分析具有很大的实用价值。

关键词：牛血清白蛋白牛乳亲和层析

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国生物工程杂志 2021年第6期41卷 38-44页

作者：张玲曹小丹杨海旭李文蕾天士力生物医药股份有限公司天津300410

生物制药行业迅速发展,尤其是上游表达量的增加和规模的扩大,促使上游培养采用连续灌流方式,同时也推动了下游纯化生产工艺相应的采取连续纯化策略。以灌流培养的Fc融合蛋白为例,采用BioSMB PD设备,对比了下游工艺亲和层析捕获步骤中单... 详细信息

生物制药行业迅速发展,尤其是上游表达量的增加和规模的扩大,促使上游培养采用连续灌流方式,同时也推动了下游纯化生产工艺相应的采取连续纯化策略。以灌流培养的Fc融合蛋白为例,采用BioSMB PD设备,对比了下游工艺亲和层析捕获步骤中单柱批次纯化和连续流层析纯化的样品纯度和收率,并在此基础上进行小试工艺放大和生产实际用量成本计算评估。连续流层析实现了上游灌流培养与下游亲和层析连续化的可行性,工艺稳定,回收率与批次纯化接近,但相比批次纯化,生产效率明显提高,填料载量提高,同时填料使用效率提高,生产成本显著降低。

关键词：亲和层析连续流层析批次纯化

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亲和层析固定相的制备及应用研究

化学研究与应用 2013年第4期25卷 457-461页

作者：莫旖柳畅先中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室湖北武汉430074

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,氨基三乙酸(NTA)为配基,制备固载金属离子的亲和吸附剂,试验了交联剂浓度、配基浓度、偶联温度及时间对配体固载量的影响,最佳条件为戊二醛浓度0.55%、NTA浓度0.4mol·L-1、偶联温度65℃、偶联时间10h。... 详细信息

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,氨基三乙酸(NTA)为配基,制备固载金属离子的亲和吸附剂,试验了交联剂浓度、配基浓度、偶联温度及时间对配体固载量的影响,最佳条件为戊二醛浓度0.55%、NTA浓度0.4mol·L-1、偶联温度65℃、偶联时间10h。层析分离纯化豆类脲酶,锌柱和镍柱的酶回收率分别为88.5%和80.4%,纯化倍数分别为3.7和6.1,实验结果表明镍柱对脲酶有较高的分离纯化选择性。

关键词：亲和层析脲酶壳聚糖