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亮氨酸通过PI3K-AKT信号通路促进牛成肌细胞的增殖

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 142-152页

作者：苗舒安济山王祚肖定福兰欣怡刘磊沈维军万发春湖南农业大学动物科学技术学院长沙410128 湖南农业大学动物医学院长沙410128

旨在探究外源补充亮氨酸(Leu)对牛成肌细胞增殖的影响及其作用机理。本试验以牛成肌细胞为研究对象,利用CCK-8法和EdU染色法检测不同浓度的Leu对牛成肌细胞增殖的影响,确定Leu的最佳添加浓度;以最佳浓度Leu为处理组、0 mmol·L^(-1)Leu... 详细信息

旨在探究外源补充亮氨酸(Leu)对牛成肌细胞增殖的影响及其作用机理。本试验以牛成肌细胞为研究对象,利用CCK-8法和EdU染色法检测不同浓度的Leu对牛成肌细胞增殖的影响,确定Leu的最佳添加浓度;以最佳浓度Leu为处理组、0 mmol·L^(-1)Leu为对照组进行转录组测序(RNA-Seq),筛选Leu调控牛成肌细胞增殖的关键通路。利用qRT-PCR验证关键通路中的关键调控基因,并通过添加抑制剂进行进一步验证。结果显示,添加Leu可提高牛成肌细胞活力,其中0.5 mmol·L^(-1)Leu显著提高成肌细胞活力和EdU阳性率(P<0.05)。Leu组和对照组差异表达基因有1290个,其中688个上调,602个下调。KEGG富集分析,所注释的309个上调基因涉及47条显著富集通路,其中与骨骼肌生长发育相关通路中最为显著的是PI3K-AKT信号通路,包含34个上调基因。随机挑选PIK3 R1、FOXO3、IRS1、RPTOR、MTOR和MET等6个差异表达基因进行qRT-PCR验证,结果与RNA-Seq一致。添加PI3K-AKT信号通路中PI3K的抑制剂LY294002后,阻断了Leu对牛成肌细胞增殖的促进作用。综上所述,Leu可通过PI3K-AKT信号通路促进牛成肌细胞的增殖。

关键词：亮氨酸牛骨骼肌成肌细胞增殖 RNA-Seq PI3K-AKT

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亮氨酸对黄牛皮下脂肪细胞棕色化的影响

畜牧兽医学报 2023年第8期54卷 3286-3298页

作者：郭逸芯王之盛胡瑞王俊梅王森施丽媛张晓红邹华围左家学彭全辉薛白王立志四川农业大学动物营养研究所肉用牛低碳养殖创新团队四川省牛低碳养殖与安全生产高校重点实验室成都611130 临沧市畜牧技术推广站临沧677099

旨在分离黄牛皮下前体脂肪细胞,探究亮氨酸对白色脂肪细胞棕色化以及脂质代谢的影响。本研究采取4头3岁的健康雄性黄牛((351.7±42.5)kg)皮下脂肪组织分离前体脂肪细胞,混合后于细胞分化D 6-D 9添加不同浓度亮氨酸(0、0.5、1、2、4、8 m... 详细信息

旨在分离黄牛皮下前体脂肪细胞,探究亮氨酸对白色脂肪细胞棕色化以及脂质代谢的影响。本研究采取4头3岁的健康雄性黄牛((351.7±42.5)kg)皮下脂肪组织分离前体脂肪细胞,混合后于细胞分化D 6-D 9添加不同浓度亮氨酸(0、0.5、1、2、4、8 mmol·L^(-1))(n=6)。RT-PCR检测棕色化标志基因,筛选亮氨酸诱导脂肪细胞棕色化的浓度,后续试验分为对照组(CON)和最佳浓度亮氨酸添加组(Leu)(n=6)。RT-PCR检测线粒体生物合成关键基因表达、mtDNA拷贝数以及脂质代谢相关基因的表达,Western Blot检测棕色化关键蛋白以及信号通路蛋白表达。Mito-tracker Green染色和油红O染色分别检测细胞内线粒体含量和脂滴形态的变化。结果表明,成功分离得到黄牛皮下前体脂肪细胞并诱导为成熟脂肪细胞。4 mmol·L^(-1)亮氨酸显著提高脂肪细胞中棕色化标志因子UCP1、PRDM 16和TMEM 26的mRNA相对表达量,线粒体生物合成关键基因SIRT1、TFAM和NRF 1/2的mRNA相对表达量,上调关键蛋白UCP1、CD137和SIRT1的表达量(P亮氨酸显著提高细胞中mtDNA拷贝数和线粒体含量(P亮氨酸抑制脂肪合成基因ACC、FAS表达,促进脂肪分解基因ATGL、HSL和脂肪酸β氧化基因PPARα、CPT1、ACOX表达(P亮氨酸极显著上调p-AMPKα/AMPKα和PGC1α的蛋白表达量(P亮氨酸能促进黄牛脂肪细胞棕色化和线粒体生物合成,促进脂肪分解抑制脂肪合成,减少细胞内脂质沉积,并上调p-AMPKα/AMPKα和PGC1α的蛋白表达量。

关键词：亮氨酸黄牛原代脂肪细胞棕色化线粒体生物合成

亮氨酸对不同动物体外胰腺组织消化酶分泌的比较研究

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饲料工业 2023年第4期44卷 28-33页

作者：张展赫马轩王梦雅李茹邵凯吴东霖徐明内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古呼和浩特010018 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

为了比较亮氨酸对不同动物胰腺消化酶分泌的影响及其是否存在种间差异,试验利用体外组织培养的方法进行研究。试验一:选取5头西门塔尔育肥牛,屠宰后立即取出胰腺组织,切成小块置于含不同浓度亮氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer(K... 详细信息

为了比较亮氨酸对不同动物胰腺消化酶分泌的影响及其是否存在种间差异,试验利用体外组织培养的方法进行研究。试验一:选取5头西门塔尔育肥牛,屠宰后立即取出胰腺组织,切成小块置于含不同浓度亮氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer(KRB)溶液中,亮氨酸梯度设置为0、2.62、5.24、10.48 mg/mL,每个处理5个重复,培养1 h后取胰腺组织和KRB培养液,测定消化酶活性;用相同方法处理羊、猪、鸡。试验二采用双因素交互试验设计,取牛、羊、猪、鸡胰腺组织,亮氨酸梯度设置为0、5.24 mg/mL,每个处理5个重复,培养1 h后收集胰腺组织和KRB培养液测定酶活性。结果表明:(1)亮氨酸可以线性提高牛胰腺组织释放的α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性(P亮氨酸显著影响胰腺组织释放的α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P0.05),动物种类与亮氨酸对胰腺组织消化酶分泌有交互影响(P亮氨酸能够提升牛、羊、猪、鸡体外胰腺组织消化酶的分泌和释放,且亮氨酸对不同动物体外胰腺组织消化酶的分泌存在种间差异。

关键词：亮氨酸消化酶活性胰腺体外种间差异

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亮氨酸在糖尿病肾组织损伤中的作用

亮氨酸在糖尿病肾组织损伤中的作用

作者：高原河北医科大学

学位级别：硕士

目的:最新的调查结果显示,目前全球糖尿病总人数已超过5亿,且最主要的以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者居多。中国目前T2DM的发病率已超过全球平均水平,高达11.6%。糖尿病作为一种常见病及多发病,其并发症广泛累及多个器... 详细信息

目的:最新的调查结果显示,目前全球糖尿病总人数已超过5亿,且最主要的以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者居多。中国目前T2DM的发病率已超过全球平均水平,高达11.6%。糖尿病作为一种常见病及多发病,其并发症广泛累及多个器官,从而造成严重的病变。其中累及到肾脏的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是最常见的并发症之一。糖尿病肾病作为一种慢性肾病,其病理特征包括肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化、白细胞浸润等。糖尿病肾病的发病机制复杂多样。到目前为止,对其病因及发病机制的研究仍尚不清楚。支链氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸[Leu]、异亮氨酸[Ile]和缬氨酸[Val]。有研究发现支链氨基酸的血液水平与胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病呈正相关。支链氨基酸尤其是亮氨酸长期以来与2型糖尿病的发病相关。亮氨酸除了具有作为合成各类蛋白质的原料这一基本生物学功能外,还能作为信号分子广泛参与细胞内的各种生理或生化代谢过程。据报道,亮氨酸可以通过影响代谢紊乱从而参与糖尿病的发生发展。我们前期的代谢组学发现,在高糖环境下,足细胞中的亮氨酸含量明显增加。由此引发猜想:糖尿病环境下,亮氨酸水平升高是否会引起肾组织损伤,进而影响肾功能,参与糖尿病肾病的发生发展?因此,本研究拟以2型糖尿病小鼠与人肾近端小管上皮细胞(Human Renal Cortex Proximal Tubule Epithelial Cells,HK2)为研究对象,探讨亮氨酸在糖尿病肾病肾组织损伤中的作用,为明确糖尿病肾病的相关病因及发病机制,探索糖尿病肾病的防治方法提供实验依据。方法:1.亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾组织损伤及脂质沉积中的作用8周龄的CD-1小鼠(购自维通利华)20只随机分为两组,正常对照组,采用普通饲料喂养;2型糖尿病组,进行高脂饲料喂养(脂含量60%),8周后腹腔连续注射STZ 50mg/kg的三次,诱导2型糖尿病模型。以空腹血糖浓度连续3次检测超过11.1m M确认糖尿病小鼠模型构建成功。正常对照组小鼠注射等量的溶媒(0.1m M柠檬酸缓冲液,PH值为4.5)。造模成功后,正常组及2型糖尿病组小鼠随机分正常饮水组和亮氨酸组。亮氨酸组以饮水中添加1.5%的亮氨酸喂养。喂养四周后,收集小鼠24h尿,处死动物取血、肾组织。肾组织取材分成三部分,包括石蜡、冰冻以及新鲜组织。1.1亮氨酸对2型糖尿病小鼠生化指标的影响南京建成检测试剂盒检测小鼠24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的含量。统计学分析。中生北控试剂盒检测血甘油三酯、胆固醇、组织游离脂肪酸的含量。1.2亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小球损伤中的作用过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)观察小鼠肾小球形态学的改变,免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测肾小球足细胞标志物Nephrin、Synaptopodin的表达,蛋白质印迹(Western blot)检测足细胞标志物nephrin蛋白的表达。1.3亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积以及EMT中的作用。⑴亮氨酸在2型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞脂质沉积中的作用。油红O染色检测肾组织内脂质沉积情况,免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1的表达,western blot检测脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白的表达。⑵亮氨酸在2型糖尿病小鼠EMT及巨噬细胞浸润中的作用。免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测EMT相关指标FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin、CD68的表达,蛋白质印迹(Western blot)检测FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的表达。2.亮氨酸在人肾小管上皮细胞脂代谢及EMT中的作用。将人肾小管上皮细胞(HK2)分为对照组(control)、亮氨酸组(Leu)、高糖组(HG)、高糖加亮氨酸组(HG+Leu)以及高糖去亮氨酸组(HG-Leu)。待细胞融合60%时分别加亮氨酸和高糖刺激,孵育48h后收集细胞。Western blot检测EMT相关指标FN、E-Cadherin、α-SMA、Vimentin,脂代谢相关指标ADRP、SREBP-1蛋白的表达。油红O染色检测不同浓度以及不同时间的亮氨酸刺激下肾小管上皮细胞脂质沉积的情况。3.统计学分析实验结果采用SPSS21.0统计分析软件进行数据处理,正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两组间数据比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验,P亮氨酸加重正常及2型糖尿病小鼠肾组织损伤及脂质的沉积1.1亮氨酸加重2型糖尿病小鼠

关键词： 2型糖尿病糖尿病肾病脂质沉积上皮间充质转化亮氨酸

亮氨酸对泌乳奶山羊生产性能和小肠淀粉消化的影响及机制

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亮氨酸对泌乳奶山羊生产性能和小肠淀粉消化的影响及机制

作者：陈捷西北农林科技大学

学位级别：硕士

淀粉在瘤胃、小肠和大肠降解的主要产物依次为挥发性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）、葡萄糖和VFA,可见反刍动物消化利用淀粉的位点显著影响淀粉的能量效率。姚军虎等提出日粮淀粉能量利用效率（SEF）的理论公式:SEF（%）=0.7 RDS+1... 详细信息

淀粉在瘤胃、小肠和大肠降解的主要产物依次为挥发性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）、葡萄糖和VFA,可见反刍动物消化利用淀粉的位点显著影响淀粉的能量效率。姚军虎等提出日粮淀粉能量利用效率（SEF）的理论公式:SEF（%）=0.7 RDS+1.0SIDS+0.4 LIDS,其中RDS、SIDS和LIDS分别为淀粉在瘤胃、小肠和大肠的降解量占总摄入淀粉量的百分比。然而,反刍动物小肠淀粉消化率约为60%,小肠淀粉消化能力的不足限制了淀粉的能量价值。研究表明,胰腺α-淀粉酶分泌不足是限制反刍动物小肠淀粉消化利用的关键因素。本团队对青年奶牛和奶山羊的研究表明,亮氨酸可通过m TOR信号通路刺激胰腺α-淀粉酶的分泌。然而,上述研究局限于细胞或组织水平,或试验动物处于瘘管手术状态,不能完全反映动物处于正常生理状态下亮氨酸的作用。另外,通过营养调控措施促进胰腺α-淀粉酶分泌后是否会提高反刍动物小肠淀粉消化率仍未知,亮氨酸对泌乳奶山羊生产性能的影响仍有待研究。基于此,本研究拟在泌乳奶山羊日粮中添加过瘤胃亮氨酸（rumen-protected leucine,RP-Leu）,并将反刍动物主要的限制性氨基酸、蛋白质合成底物-赖氨酸作为对照,评估亮氨酸对泌乳奶山羊生产性能和小肠淀粉消化的影响,为功能性氨基酸在泌乳奶山羊饲养中的应用提供理论依据。试验一过瘤胃亮氨酸对泌乳奶山羊生产性能和免疫指标的影响本研究旨在评估日粮添加RP-Leu对泌乳奶山羊生产性能和免疫指标的影响。试验选取45头初产关中泌乳奶山羊,泌乳期135±15 d,泌乳量2.06±0.45 kg/d,体重43.11±5.38 kg,随机均分3组:对照组（CON,采食基础日粮）、过瘤胃亮氨酸添加组（LEU,基础日粮+10.6 g/d RP-Leu）及过瘤胃赖氨酸添加组（LYS,基础日粮+12.0 g/d RP-Lys）。试验期60 d,其中预饲期15 d,正试期45 d。正试期开始与结束时连续2 d称量奶山羊的体重,每周连续2 d记录奶山羊的产奶量作为本周的产奶量,试验结束后采集瘤胃液、血液、直肠粪便样品、奶样进行分析。试验结束后,将所有试验羊混入大群统一饲养,并持续跟踪试验羊的后续情况,包括产羔率、产羔数量、体重变化等指标。结果表明,与CON组相比,日粮添加RP-Leu提高了奶山羊的平均日增重（P＜0.05）,对采食量、产奶量和乳成分无影响（P＞0.05）,趋于提高体重校正乳产奶效率（0.05≤P＜0.10）;日粮添加RP-Lys对泌乳奶山羊生长性能和泌乳性能无影响（P＞0.05）。繁殖性能方面,3组间追踪体重、体重变化和羔羊初生重无差异（P＞0.05）,与CON组相比,LEU组的产羔率提高了28%。日粮添加RP-Leu和RP-Lys对泌乳奶山羊血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、球蛋白、Ig A、IL-6、IL-1β、IFN-γ和TNF-α无显著影响（P＞0.05）。本研究表明,日粮添加RP-Leu提高了泌乳奶山羊日增重,趋于提高体重校正乳产奶效率,对免疫性能无显著影响。试验二亮氨酸对泌乳奶山羊小肠淀粉消化的影响作为反刍动物主要的限制性氨基酸,赖氨酸对泌乳奶山羊的生产性能无影响,而添加亮氨酸可提高奶山羊体增重,并趋于提高产奶效率,说明亮氨酸除作为合成蛋白质的底物外,还具有其他作用。因此,在试验一的基础上,试验二进一步解析亮氨酸对泌乳奶山羊小肠淀粉消化能力的影响,以剖析日增重增加的可能原因,不再讨论赖氨酸的影响。试验设计和动物饲养同试验一,检测营养物质全消化道表观消化率、瘤胃和直肠粪便发酵参数、直肠粪便微生物、血液生化、血清游离氨基酸和乳水解氨基酸等指标。结果显示,日粮添加RP-Leu不影响泌乳山羊全消化道淀粉表观消化率和瘤胃发酵参数（P＞0.05）。LEU组的奶山羊粪便中丁酸盐摩尔比例降低,而p H值和乙酸比例上升（P＜0.05）。革兰氏阳性菌Firmicutes和革兰氏阴性菌Bacteroidetes是直肠粪便微生物门水平中丰度最高的细菌,两种菌的总丰度占总细菌丰度的90%左右。亮氨酸改变了粪便微生物组成,增加了粪便中Christensenellaceae、Christensenellaceae＿R-7、Ruminococcaceae和Ruminococcus的相对丰度,降低了Lachnospiraceae和Anaerostipes的相对丰度（P＜0.05）。日粮添加RP-Leu提高了奶山羊血清中低密度脂蛋白胆固醇的含量（P＜0.05）,趋于提高总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇含量（0.05≤P＜0.10）。LEU组提高了泌乳奶山羊血清中BCAA、Ile、Thr、Leu和EAA的含量,降低了Pro的含量（P＜0.05）,趋于提高Trp和TAA的含量（0.05≤P＜0.10）。日粮添加RP-Leu不影响泌乳奶山羊乳氨基酸组成（P＞0.05）。本研究表明,日粮

关键词：亮氨酸泌乳奶山羊淀粉小肠氨基酸代谢

亮氨酸对3T3-L1前脂肪细胞分化及分化后脂肪生成的影响

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中华预防医学杂志 2016年第6期50卷 535-540页

作者：杨江涛徐加英焦俊张茹韩淑芬秦立强苏州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 215123 苏州大学放射医学与防护学院江苏省高校放射医学协同创新中心苏州开拓药业有限公司

目的：观察亮氨酸对3T3-L1前脂肪细胞分化和分化后脂肪生成的影响并初步探讨其机制。方法培养3T3-L1前脂肪细胞，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测0.0（对照组）、0.5、1.0和2.0 mmol/L亮氨酸处理2 d对细胞增殖的影响。诱导3T3-L1前脂... 详细信息

目的：观察亮氨酸对3T3-L1前脂肪细胞分化和分化后脂肪生成的影响并初步探讨其机制。方法培养3T3-L1前脂肪细胞，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测0.0（对照组）、0.5、1.0和2.0 mmol/L亮氨酸处理2 d对细胞增殖的影响。诱导3T3-L1前脂肪细胞分化，分别在诱导开始（维持整个分化过程）以及分化完成后（持续4d）进行亮氨酸处理。油红O染色检测细胞中脂滴数，收集培养基，测定其甘油含量，同时采用Western blot法测定脂肪分解相关酶、瘦素信号通路相关蛋白的表达水平。结果通过0.0、0.5、1.0和2.0 mmol/L亮氨酸处理后细胞存活率分别为（100.00±12.10）%,（102.73±12.38）%,（103.94±14.65）%和（108.70±5.05）%，差异无统计学意义（F=1.07, P=0.383）。细胞分化过程中，0.0、0.5、1.0、2.0 mmol/L亮氨酸处理组的脂滴相对数分别为1.00±0.06、0.94±0.09、0.82±0.08和0.79±0.04（F=11.74, P〈0.001），1.0、2.0 mmol/L亮氨酸组低于对照组（P值分别0.002、〈0.001）；分化完成后亮氨酸处理的各组脂滴相对数的差异无统计学意义（F=0.16, P=0.924）。细胞分化过程中用0.0、0.5、1.0和2.0 mmol/L亮氨酸处理，培养基中甘油含量增值分别为（65.04±11.75）、（71.45±23.71）、（79.37±17.63）和（110.32±25.36）μmol/L（F=2.92, P=0.100），2.0 mmol/L亮氨酸组含量高于对照组（t=2.73, P=0.026）；分化完成后亮氨酸处理的各组甘油含量增值的差异无统计学意义（F=0.80, P=0.528）。分化过程中采用亮氨酸处理，上调了磷酸化激素敏感脂肪酶的蛋白表达[采用0.0、2.0 mmol/L浓度的亮氨酸处理后，蛋白相对表达水平分别为1.00±0.08、2.54±0.27（P〈0.001）]，下调了脂滴包被蛋白、瘦素和瘦素通路相关的瘦素受体、Janus激酶2和信号转导和转录激活因子的蛋白的表达[采用0.0、2.0 mmol/L浓度的亮氨酸处理后，相应蛋白相对表达水平分别为[（1.00±0.03）比（0.31±0.07）、（1.00±0.08）比（0.22±0.07）、（1.00±0.07）比（0.21±0.04）、（1.00±0.03）比（0.35±0.05）、（1.00±0.06）比（0.34±0.05），P值均〈0.001]。结论亮氨酸通过调控脂肪分解酶和瘦素信号通路抑制了脂肪细胞分化过程中脂肪的形成，但对分化完成后的脂肪细胞无影响。

关键词：亮氨酸脂细胞脂肪分解脂滴瘦素信号通路

亮氨酸对黄牛皮下和肌内脂肪细胞棕色化及线粒体生物合成的影响

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亮氨酸对黄牛皮下和肌内脂肪细胞棕色化及线粒体生物合成的影响

作者：郭逸芯四川农业大学

学位级别：硕士

脂肪是肉牛育肥饲养中重要的营养物质沉积形式。脂肪沉积的部位和沉积量不但影响肉牛胴体质量和牛肉品质,也影响生产成本和养殖效益,提高肌内脂肪沉积,降低皮下脂肪沉积是生产上节本增效的追求目标。白色脂肪细胞在一定刺激下转变为米... 详细信息

脂肪是肉牛育肥饲养中重要的营养物质沉积形式。脂肪沉积的部位和沉积量不但影响肉牛胴体质量和牛肉品质,也影响生产成本和养殖效益,提高肌内脂肪沉积,降低皮下脂肪沉积是生产上节本增效的追求目标。白色脂肪细胞在一定刺激下转变为米色脂肪细胞,称为“白色脂肪细胞棕色化”。米色脂肪细胞功能类似于棕色脂肪细胞,可以通过非颤抖性产热维持幼畜体温,促进化学能以热能形式耗散,减少脂肪沉积,改善肉品质。亮氨酸作为一种重要的功能性氨基酸,除了能促进蛋白质合成外,对脂肪代谢也有一定调节作用,但其对白色脂肪细胞棕色化现象的调节作用的研究报道较少,调节机制也尚不清楚。因此,本研究分离黄牛皮下和肌内原代前体脂肪细胞,研究亮氨酸对黄牛白色脂肪细胞棕色化和线粒体生物合成的调控作用。对探究肉牛脂肪的营养代谢调控和机体养分沉积具有重要意义。试验一黄牛皮下和肌内前体脂肪细胞的分离与鉴定取成年黄牛颈背部皮下脂肪组织和背最长肌组织,分离皮下和肌内前体脂肪细胞,之后进行生长曲线测定和免疫荧光鉴定。前体脂肪细胞诱导分化的过程中进行油红O染色,RT-PCR检测分化关键基因PPARγ、C/EBPα、ACC、FABP4和ADIPOQ的m RNA相对表达量。结果如下:(1)黄牛皮下和肌内前体脂肪细胞分别分离培养1 d时,有少量细胞贴壁,形态呈短梭型,之后逐渐伸展呈纤维状。细胞在培养的第3 d进入对数生长期,第7 d进入平台期,生长曲线呈“S”型。前体脂肪细胞标志蛋白PREF-1荧光表达阳性且位于细胞膜。随着分化时间的推移,细胞内脂质含量显著增加(P亮氨酸对黄牛皮下和肌内脂肪细胞棕色化和线粒体生物合成的影响在分化第6-9 d,向皮下和肌内脂肪细胞的维持培养基中额外添加0、0.5、1、2、4、8 m M的亮氨酸,RT-PCR检测棕色化标志基因,筛选亮氨酸诱导前体脂肪细胞棕色化的浓度,后续试验分为对照组(CON)和适宜浓度亮氨酸添加组(Leu)。RT-PCR检测线粒体生物合成关键基因表达、mt DNA拷贝数以及脂质代谢相关基因表达的影响。Western Blot检测棕色化关键蛋白以及信号通路蛋白表达,Mito-tracker Green荧光探针染色和油红O染色分别检测棕色化发生后细胞内线粒体含量和脂滴形态的变化,来验证亮氨酸是否成功诱导棕色化现象的发生。结果如下:(1)4 m M和2 m M亮氨酸分别促进皮下和肌内脂肪细胞UCP1、PRDM16、TMEM26、Cidea、Cited1的m RNA相对表达量(P亮氨酸分别促进皮下脂肪和肌内脂肪细胞UCP1、CD137和SIRT1的蛋白表达量(P亮氨酸分别处理皮下和肌内脂肪细胞。(2)4 m M和2 m M亮氨酸分别处理皮下和肌内脂肪细胞后,细胞内脂滴由单房大脂滴向多房小脂滴转变,细胞内的脂质含量显著降低(P亮氨酸添加显著增加线粒体生物合成关键基因的m RNA相对表达量(P亮氨酸分别处理皮下和肌内脂肪细胞后,两种细胞的AMPKα1和PGC1α的m RNA相对表达量显著增加(P亮氨酸诱导皮下和肌内脂肪细胞棕色化的最适浓度存在差异。亮氨酸促进皮下和肌内脂肪细胞棕色化和线粒体生物

关键词：亮氨酸黄牛原代脂肪细胞棕色化线粒体生物合成

亮氨酸及复合蛋白肽对高脂诱导动物能量代谢紊乱的干预作用

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亮氨酸及复合蛋白肽对高脂诱导动物能量代谢紊乱的干预作用

作者：赵慧文山东大学

学位级别：硕士

研究目的超重和肥胖是慢性非传染性疾病包括2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病等的独立危险因素,近年来超重和肥胖发生率持续增长,已成为我国重大公共卫生问题。探索基于膳食成分对能量代谢紊乱的新型干预措施具有重要的现实意义... 详细信息

研究目的超重和肥胖是慢性非传染性疾病包括2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病等的独立危险因素,近年来超重和肥胖发生率持续增长,已成为我国重大公共卫生问题。探索基于膳食成分对能量代谢紊乱的新型干预措施具有重要的现实意义。研究显示亮氨酸与机体的能量代谢密切相关,但研究证据并不完全一致。本研究首先采用亮氨酸作为干预剂,观察了其对常规饲料和高脂饲料喂养小鼠体内脂肪及能量代谢的影响;其后制备富含亮氨酸的复合蛋白肽,观察了其对高脂诱导肥胖大鼠糖脂代谢的影响。研究方法C57BL/6J雄性小鼠分别喂饲常规饲料和高脂饲料,并分为经饮水补充或不补充亮氨酸组,持续喂养24周,观察不同处理对动物体重、血糖及血脂的影响,油红O染色显示了肝脏中脂肪含量的变化;采用Oxymas/CLAMS动物代谢系统记录观察了不同处理对动物能量代谢的改变,Western blot检测了小鼠肝脏组织中脂肪酸合成酶(FAS)和脂肪酸结合蛋白(FABP4)的表达、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活和下游效应分子SIRT1的表达、及肝脏支链α-酮酸脱氢酶E1α(BCKDE1A)活性的变化。高脂饲料诱导SD雄性大鼠肥胖,然后给予添加不同比例富含亮氨酸的复合蛋白肽的饲料喂养30天,观察了其对肥胖大鼠体重、体内脂肪含量的影响,葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)观察了肥胖大鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性变化,油红O染色观察了肝脏脂肪蓄积情况,Western blot检测了脂肪组织中激素敏感性脂肪酶(HSL)的磷酸化激活、甘油三酯脂肪酶(ATGL)及线粒体呼吸链复合物和解偶联蛋白1(UCP1)表达的变化。研究结果喂饲高脂饲料组小鼠体重显著增加,同时补充亮氨酸使高脂喂养动物体重增加降低,在一定程度上降低了高脂喂饲动物的血糖和血脂水平,减轻了肝脏中脂肪蓄积;亮氨酸明显增加了高脂喂养动物昼夜O2消耗量、CO2呼出量和产热,降低了呼吸交换率,增加了能量代谢;亮氨酸明显下调了高脂喂养动物肝脏FAS和FABP4的表达、增强了 AMPK的磷酸化激活,增加了 SIRT1和PGC-1α的表达,并逆转了高脂诱导的肝脏BCKDE1A磷酸化。高脂诱导肥胖大鼠采用添加不同比例的富含亮氨酸的复合蛋白肽饲料喂养30天,动物体重明显降低,体内白色脂肪和肝脏脂肪含量显著减少,均呈剂量效应关系;大鼠血糖和血脂也明显降低,但葡萄糖耐量和胰岛素敏感性变化不大;同时动物体内白色脂肪及棕色脂肪中p-HSL水平和ATGL表达升高,棕色脂肪组织中线粒体氧化磷酸化复合物和UCP1表达也明显上调。研究结论1.小鼠长期补充亮氨酸,能够促进能量代谢,并有效减轻高脂饲料喂饲导致的体重增加、肝脏脂肪蓄积、以及血糖和血脂升高;其作用机制可能与亮氨酸能有效激活肝脏AMPK-SIRT1通路,促进线粒体发生,降低脂肪酸合成,并促进肝脏亮氨酸分解代谢相关。2.富含亮氨酸的复合蛋白肽能降低高脂饲料诱导肥胖大鼠的体重、体内白色脂肪含量和血脂水平,减少肝脏脂肪蓄积;其作用机制可能与激活脂肪组织脂肪酶HSL、增加ATGL表达,以及上调线粒体氧化磷酸化复合物和UCP1的表达,刺激脂肪分解和产热有关。

关键词：亮氨酸蛋白肽肥胖能量代谢糖脂代谢

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仿刺参幼参对亮氨酸最适需求量的研究

水产学报 2022年第2期46卷 238-249页

作者：刘财礼王际英李宝山沈钰博孙永智黄炳山王世信上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心山东省海洋资源与环境研究院山东省海洋生态修复重点实验室

为探究仿刺参幼参对亮氨酸的最适需求量，在基础饲料中分别添加0.00%、0.80%、1.60%、2.40%、3.20%和4.00%的包膜亮氨酸，配成亮氨酸含量分别为1.29%(D1，对照组)、1.63%(D2)、1.98%(D3)、2.22%(D4)、2.58%(D5)和2.97%(D6)的6组实验饲料，饲喂初始体质量为(16.40±0.14) g的仿刺参幼参60 d。结果显示，(1)随饲料亮氨酸含量从1.29%提高到1.98%，仿刺参幼参的增重率和特定生长率显著升高，在D3组增重率达到最大值100.84%,随亮氨酸含量进一步提高，增重率和特定生长率显著降低，但D3、D4和D5组增重率和特定生长率还是显著高于对照组；(2)随饲料亮氨酸含量从1.29%提高到1.98%，仿刺参体壁的粗脂肪含量显著升高，在D3组达到最大值5.50%，且显著高于其他组，随亮氨酸含量进一步提高，仿刺参体壁粗脂肪含量显著降低，各组间水分、粗蛋白质和粗灰分含量均无显著性差异；随饲料亮氨酸含量的升高，仿刺参体壁蛋氨酸含量显著提高；(3)随饲料亮氨酸含量从1.29%提高到1.98%，仿刺参肠道脂肪酶和蛋白酶活性显著提高，饲料亮氨酸含量进一步提高时，脂肪酶和蛋白酶活性均显著降低，D3组脂肪酶活性显著高于其他组，D2、D3和D4组蛋白酶活性显著高于其他组；(4)随饲料亮氨酸含量从1.29%提高到1.98%，仿刺参肠道谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性和总抗氧化能力显著升高，超过1.98%后，谷草转氨酶活性趋于平稳，而谷丙转氨酶活性和总抗氧化能力显著降低，D3组谷丙转氨酶活性显著高于其他组，D3组总抗氧化能力显著高于D1、D2、D5和D6组，随饲料亮氨酸含量从1.29%提高到1.98%，仿刺参肠道丙二醛含量显著降低，当饲料亮氨酸含量超过2.22%后，丙二醛含量显著升高，D3和D4组丙二醛含量显著低于其他组。研究表明，以增重率为评价指标，经一元二次回归分析得出，体质量为(16.40±0.14) g的仿刺参幼参对饲料中亮氨酸的最适需求量为2.11%(10.37%饲料粗蛋白质)。

关键词：仿刺参亮氨酸生长免疫消化酶