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产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

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微生物学通报 2012年第11期39卷 1580-1588页

作者：孙苗苗陈辉吴坚平杨立荣浙江大学化学工程与生物工程学系浙江杭州310027

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、*** BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTra... 详细信息

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、*** BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。

关键词：产碱假单胞菌脂肪酶克隆表达

产碱假单胞菌在油菜根圈定殖的动态和分布研究

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中国油料作物学报 2002年第4期24卷 54-56页

作者：胡小加刘胜毅 Daniel Roberts 中国农业科学院油料作物研究所农业部油料作物遗传改良重点实验室国家油料作物改良中心湖北武汉430062 Sutainable Agricultural Systems Laboratory USDA-ARS Beltsville Research Center

采用LacZ基因标记技术和常规方法跟踪产碱假单胞菌A9(LacZ)在缩影系统油菜根圈的定殖情况。A9(LacZ)在油菜不同根段部位的定殖密度,表现从上到下逐渐递减的现象,随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段8cm以外的根区几乎检测不到接种... 详细信息

采用LacZ基因标记技术和常规方法跟踪产碱假单胞菌A9(LacZ)在缩影系统油菜根圈的定殖情况。A9(LacZ)在油菜不同根段部位的定殖密度,表现从上到下逐渐递减的现象,随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段8cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后3d,定殖密度可达最高水平(7.6×105个/g),然后急速下降,30d后保持相对稳定的较低水平(1.1×102个/g)。

关键词：菌株动态区域分布产碱假单胞菌油菜根圈定植

一种产碱假单胞菌产生的地塞米松降解酶的提取纯化和鉴定

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生物医学工程学杂志 2015年第5期32卷 1044-1049页

作者：朱黎黎杨致邦杨茜石中全邓西川重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室重庆400016 重庆医科大学基础医学实验教学中心病原生物学与免疫学实验室重庆400016 重庆三峡医药高等专科学校免疫学与病原生物学教研室重庆404120

将分离到的1株对地塞米松有降解作用的产碱假单胞菌进一步驯化。采用渗透休克法分离该菌各区域蛋白,将分离的具有高酶活性的胞内蛋白用硫酸铵盐析、离子交换层析和葡聚糖凝胶层析提取和纯化。纯化蛋白用HPLC检测其对地塞米松的降解活性... 详细信息

将分离到的1株对地塞米松有降解作用的产碱假单胞菌进一步驯化。采用渗透休克法分离该菌各区域蛋白,将分离的具有高酶活性的胞内蛋白用硫酸铵盐析、离子交换层析和葡聚糖凝胶层析提取和纯化。纯化蛋白用HPLC检测其对地塞米松的降解活性,酶切后质谱鉴定。结果表明驯化后的产碱假单胞菌对地塞米松的降解率从23.63%提高到52.84%,降解地塞米松的酶主要存在于该菌胞质内,分子量约为41kD;纯化后的酶蛋白比活力达到1.02U·mg-1,该蛋白的5条肽段的氨基酸序列与异戊酰辅酶A脱氢酶的部分序列匹配,可能是一种新的甾体类化合物降解酶。本文为用微生物修复技术清除水环境的地塞米松污染提供了新策略。

关键词：产碱假单胞菌地塞米松降解酶提取纯化鉴定

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产碱假单胞菌降解地塞米松相关蛋白酶的研究

产碱假单胞菌降解地塞米松相关蛋白酶的研究

作者：朱黎黎重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：本文在从医院废水中分离到一株可降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌的基础上,进一步分离提取与该菌降解有关的蛋白酶,并探讨其特性,为制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂奠定基础。方法：将分离的降解地塞... 详细信息

目的：本文在从医院废水中分离到一株可降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的产碱假单胞菌的基础上,进一步分离提取与该菌降解有关的蛋白酶,并探讨其特性,为制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂奠定基础。方法：将分离的降解地塞米松的产碱假单胞菌在地塞米松磷酸钠培养液长期反复培养训化,以提高该菌对地塞米松的降解率。再用渗透休克法提取该菌的胞外蛋白、周质蛋白和胞内蛋白,SDS-PAGE电泳分析提取的各部位蛋白,对主要蛋白进行质谱鉴定。用高效液相色谱法(HPLC)检测各部位蛋白的降解酶活性,以确定降解酶存在的部位。对具有酶活性的胞内蛋白先用硫酸铵盐析,再用离子交换层析与葡聚糖凝胶层析相结合的方法进一步提取纯化。用]HPLC法检测在纯化过程中蛋白酶的降解活性,用BCA法检测蛋白浓度,再计算出比活力,纯化倍数及回收率。将纯化后的蛋白酶切后质谱鉴定,并测定其降解反应的动力学特征。结果：地塞米松降解菌经多次驯化后,对地塞米松磷酸钠的降解率从驯化前的50.89%提高到75.7%,将地塞米松降解为其它物质的降解率从23.63%提高到74.99%。驯化菌在驯化前后对地塞米松磷酸钠与地塞米松的降解有显著的统计学差异(P菌提取到分子量约为100kDa,41kDa及20kDa三种主要蛋白质,质谱鉴定分别与TonB依赖性受体蛋白,异戊酰辅酶A脱氢酶和假定蛋白有较高的相似性。驯化菌的胞内蛋白具有较高的降解酶活性。从胞内蛋白中提取纯化到41kDa蛋白,质谱鉴定与异戊酰辅酶A脱氢酶有较高的相似性。降解酶在温度25℃-40℃和pH6.5-pH8.5条件下具有较好的降解作用,酶促反应动力学方程为Ct-C0 e-0.1769t,符合一级动力学方程。结论：本文成功驯化了所分离的地塞米松降解菌,明确了降解酶所存在的部位。成功提取了驯化菌的主要蛋白,明确了这些蛋白的性质。提取纯化了胞内蛋白中的降解酶,了解了酶蛋白的降解特性,构建了酶促反应动力学方程。为进一步制备清除环境中地塞米松类药物污染的生物净化剂提供了实验材料和理论基础。

关键词：产碱假单胞菌驯化地塞米松蛋白质降解酶特性

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonasalc aligenes)S2中卵磷脂酶的分泌

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科学通报 2005年第16期50卷 1725-1730页

作者：吕静李繁陈三凤李季伦中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2,通过形态指标、生理生化性状、16SrDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析,鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes).采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱... 详细信息

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2,通过形态指标、生理生化性状、16SrDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析,鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes).采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变,从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中,筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808,M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20).对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明,丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS,xcpX和xcpW,它们分别编码XcpS,XcpX和XcpW蛋白,这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分.将xcpS,xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上,通过双亲接合的方式分别导入上述M808,M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验,结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力.以上结果表明,在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的.解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌,造成突变株不能降解有机磷.在解磷能力增强突变株M20中,被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.

关键词： Pseudomonas alcaligenes 有机磷降解 Tn5转座子 xcpS xcpX xcpW chpA 产碱假单胞菌分泌途径

7株类产碱假单胞菌的鉴定及临床意义的探讨──附类产碱假单胞菌致同一患者多部位感染一例

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临床检验杂志 1994年第S1期12卷 117-118页

作者：李希涛王友诚赵霞山东省平阴县人民医院检验科

７株类产碱假单胞菌的鉴定及临床意义的探讨──附类产碱假单胞菌致同一患者多部位感染一例李希涛，王友诚，赵霞（山东省平阴县人民医院检验科，２５０４００）我们１９９２年１０月至１９９３年１０月先后从败血症，烧伤后感染，术后... 详细信息

７株类产碱假单胞菌的鉴定及临床意义的探讨──附类产碱假单胞菌致同一患者多部位感染一例李希涛，王友诚，赵霞（山东省平阴县人民医院检验科，２５０４００）我们１９９２年１０月至１９９３年１０月先后从败血症，烧伤后感染，术后感染，上呼吸道感染和泌尿系感染患者...

关键词：产碱假单胞菌泌尿系感染术后感染临床细菌学血平板实用医学检验学刘恭植检验科病人标本非发酵菌

产碱假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件优化

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热带生物学报 2015年第1期6卷 53-58,64页

作者：操凤刘雪冰曹献英海南大学材料与化工学院海南海口570228 海南大学食品学院海南海口570228

对产碱假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件进行了优化,结果表明,产碱假单胞菌产ADI的最佳发酵条件为:10 g·L-1蔗糖为碳源,6 g·L-1蛋白胨为氮源,10 g·L-1精氨酸诱导物,4%的接种量和30%的装液量,发酵温度29℃,发酵时间24 h,摇床转速为... 详细信息

对产碱假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件进行了优化,结果表明,产碱假单胞菌产ADI的最佳发酵条件为:10 g·L-1蔗糖为碳源,6 g·L-1蛋白胨为氮源,10 g·L-1精氨酸诱导物,4%的接种量和30%的装液量,发酵温度29℃,发酵时间24 h,摇床转速为150 r·min-1,发酵液的初始p H8.5。在此条件下,产碱假单胞菌产ADI的酶活最高。

关键词：产碱假单胞菌精氨酸脱亚胺酶发酵酶活

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黄鳝产碱假单胞菌的分离与鉴定

淡水渔业 2000年第5期30卷 33-34页

作者：马有智舒妙安浙江大学动物科学学院杭州310029

近年来,我们在黄鳝人工繁殖及苗种培育过程中,出现黄鳝苗种大批发病死亡,主要表现为口腔充血,腹部肿胀,鳝苗在水中侧身作间隙窜游,最后无力游动而下沉死亡.为了给该病的防治提供依据,我们对该病的病原菌进行了分离培养、生理生化反应测... 详细信息

近年来,我们在黄鳝人工繁殖及苗种培育过程中,出现黄鳝苗种大批发病死亡,主要表现为口腔充血,腹部肿胀,鳝苗在水中侧身作间隙窜游,最后无力游动而下沉死亡.为了给该病的防治提供依据,我们对该病的病原菌进行了分离培养、生理生化反应测定、人工感染试验及药敏试验,以期为该病的防治提供参考依据.

关键词：黄鳝产碱假单胞菌分离鉴定病原菌

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

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广西科学 2016年第3期23卷 248-254页

作者：刘滔滔刘明瑞刘恒嘉杜丽琴梁智群韦宇拓广西大学生命科学与技术学院广西南宁530005 亚热带农业资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530005

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16S rDNA... 详细信息

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16S rDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以 pET-22 b（＋）为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21（DE3）进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16 S rDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过 PCR 成功克隆到该菌的脂肪酶基因（lipPA-9A）和脂肪酶分子伴侣基因（lipPA-9B）,并构建共表达重组质粒 pET22b-lipPA-9A-9B ,实现脂肪酶 LIP-9 A的活性表达。酶学性质研究表明 LIP-9 A的最适反应温度为35℃,最适反应 pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯（pNPO）；同时,LIP-9A 还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9 A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。

关键词：产碱假单胞菌碱性脂肪酶共表达酯化