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醇脱氢酶催化合成(S)-哌啶醇及产物抑制机制

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食品与生物技术学报 2021年第7期40卷 73-80页

作者：吴彦霏许国超周婕妤倪晔江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

(S)-N-Boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP)是治疗套细胞淋巴瘤药物——依鲁替尼的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化N-Boc-3-哌啶酮(NBPO)的不对称还原是最具开发潜力的(S)-NBHP合成方法。对醇脱氢酶库进行筛选发现,来源于多孢克鲁维酵母的KpADH... 详细信息

(S)-N-Boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP)是治疗套细胞淋巴瘤药物——依鲁替尼的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化N-Boc-3-哌啶酮(NBPO)的不对称还原是最具开发潜力的(S)-NBHP合成方法。对醇脱氢酶库进行筛选发现,来源于多孢克鲁维酵母的KpADH对NBPO具有最佳的催化效果,纯酶活力高达83.9 U/mg,产物对映体过量值为97.0%(S)。将其与葡萄糖脱氢酶偶联,并考察了单水相、两相、离子液体和不同底物浓度对转化反应的影响。结果表明:高浓度产物(S)-NBHP对KpADH存在抑制作用,抑制动力学分析表明属于非竞争性抑制。采用单水相体系可降低(S)-NBHP对KpADH催化反应的抑制,有利于转化效率的提高。初步探究了醇脱氢酶催化NBPO不对称还原反应的抑制现象,对酶法合成(S)-NBHP具有指导意义。

关键词： (S)-N-Boc-3-羟基哌啶醇脱氢酶单水相催化产物抑制非竞争性抑制

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质子交换膜反应器中乙醇缓解产物抑制的机制

膜科学与技术 2019年第5期39卷 1-8页

作者：张少锋刘释水金锐王云晴吴雪梅贺高红大连理工大学化工学院膜科学与技术研究中心精细化工国家重点实验室

质子交换膜反应器反应条件温和、氢气传质阻力小,但产物抑制会导致产物积累和加氢性能下降,是一个具有挑战性的课题.本文采用分子动力学模拟从微观角度探究了模型反应马来酸加氢产生产物抑制的原因,提出乙醇缓解产物抑制的作用机制.通... 详细信息

质子交换膜反应器反应条件温和、氢气传质阻力小,但产物抑制会导致产物积累和加氢性能下降,是一个具有挑战性的课题.本文采用分子动力学模拟从微观角度探究了模型反应马来酸加氢产生产物抑制的原因,提出乙醇缓解产物抑制的作用机制.通过分析非均相体系中相互作用能、吸附能和吸附形态学,发现产物琥珀酸弱的极性和电离能力及稍强的竞争吸附能力使得其倾向远离溶剂水而吸附在碳载体表面,是产物抑制的主要原因.而乙醇可以通过溶剂化作用和竞争吸附作用降低琥珀酸与碳载体亲和力并增强其与水的亲和力,添加1 mol/L乙醇时,琥珀酸在碳载体上吸附能降低了约1.0 kcal/mol,而与混合溶剂乙醇/水相互作用能增加了2.8 kcal/mol,这可以将琥珀酸从碳载体表面释放并进入溶液中,有效缓解产物抑制.乙醇缓解产物抑制的机制可以为竞争吸附剂的优选提供理论指导,进一步提高质子交换膜反应器的非均相加氢性能.

关键词：质子交换膜反应器产物抑制溶剂化作用竞争吸附分子动力学模拟

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醋酸发酵过程中的底物抑制和产物抑制效应

中国酿造 1992年第3期11卷 22-25页

作者：郭养浩康小红李斌张雅惠福州大学轻工系

在工业常用的物料浓度范围内,研究了醋酸杆菌As1.41和某厂工业混合菌在醋酸发酵过程中的底物抑制和产物抑制效应。As1.41的发酵过程具有“非生长偶联”的动力学特性。高浓度乙醇和醋酸对菌体的生长和产酸活性都具有较显著的抑制作用,并... 详细信息

在工业常用的物料浓度范围内,研究了醋酸杆菌As1.41和某厂工业混合菌在醋酸发酵过程中的底物抑制和产物抑制效应。As1.41的发酵过程具有“非生长偶联”的动力学特性。高浓度乙醇和醋酸对菌体的生长和产酸活性都具有较显著的抑制作用,并导致发酵率下降。分批培养中,底物抑制效应主要影响菌体增殖。产物抑制效应比底物抑制效应更为显著,醋酸浓度高于6.5～7.0克/100毫升时,二种醋酸菌的产酸活性几乎丧失。从生化反应动力学角度讨论了醋酸发酵工艺的优化问题,推荐采用二步法工艺。

关键词：醋酸发酵底物抑制产物抑制食醋

麦芽糖基结合位点2区域对环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的影响研究

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麦芽糖基结合位点2区域对环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的影响研究

作者：陈双娣江南大学

学位级别：硕士

环糊精具有包合许多疏水性化合物而改善它们使用性能的作用,在各个领域具有广泛应用。工业上,环糊精的制备一般通过环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用于淀粉制备而成,但随着产物的积累,会出现明显的产物抑制现象,是造成环糊精产量较低的... 详细信息

环糊精具有包合许多疏水性化合物而改善它们使用性能的作用,在各个领域具有广泛应用。工业上,环糊精的制备一般通过环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用于淀粉制备而成,但随着产物的积累,会出现明显的产物抑制现象,是造成环糊精产量较低的一个重要因素,因此,如何降低环糊精生产过程中的产物抑制成为一个亟待解决的问题。本研究选取2种具有不同产物抑制类型的CGT酶(α-CGT酶来源于Paenibacillus macerans JFB05-01,β-CGT酶来源于Bacillus circulans STB01)为研究对象,通过生物信息学手段从酶一级结构入手,深入分析酶结构与产物抑制的关系。然后,通过单突变、双突变及片段替换对麦芽糖基结合位点2(MBS2)区域进行分子改造,以研究MBS2区域对CGT酶产物抑制的影响,并对相关机理进行了分析,同时期望得到产物抑制降低、具有工业应用价值的理想突变体。主要研究结果如下:(1)对CGT酶进行生物信息学分析,从一级结构入手,深入分析造成CGT酶产物抑制的原因,明确与CGT酶产物抑制相关的区域及氨基酸残基。根据α-CGT酶和β-CGT酶的产物抑制差异以及MBS2区域的特殊性,选定MBS2区域为研究目标,并选取该区域的600位点和603位点及整体进行结构分析,为后续突变体的构建提供指导。(2)选取MBS2区域的600位点,分别设计了4个α-CGT酶单突变体(Y600L、Y600E、Y600I和Y600R)和4个β-CGT酶单突变体(L600Y、L600E、L600I和L600R)进行比较研究。结果发现,α-CGT酶600位点突变既不改变α-CGT酶的产物抑制类型,仍为竞争性抑制,也不改变其产物抑制强弱;而β-CGT酶600位点突变体的产物抑制类型虽未发生改变,仍为线性混合型抑制,但其产物抑制强弱受到明显影响。可以推断,环糊精对α-CGT酶产生的竞争性抑制与其非活性区域MBS2的600位点没有相关性,而环糊精对β-CGT酶产生的线性混合型抑制尤其是非竞争性抑制与600位点有一定的关联性。机理分析显示,β-CGT酶600位点突变后,600位点处的氨基酸与环糊精之间的疏水相互作用减弱,进而导致产物抑制的降低。(3)选取MBS2区域的603位点,分别设计了6个α-CGT酶单突变体(N603E、N603D、N603K、N603H、N603R和N603I)和6个β-CGT酶单突变体(N603E、N603D、N603K、N603H、N603R和N603I)进行比较研究。结果发现,603位点单突变对α-CGT酶和β-CGT酶的影响同600位点类似,但其中,2种酶的N603E和N603D竞争性抑制均发生明显变化。可以推断,MBS2区域的603位点也与β-CGT酶的非竞争性抑制密切相关,而2种酶N603E和N603D的竞争性抑制强度变化可能与另一个竞争区域(MBS1)有关。机理分析显示,野生型β-CGT酶603位点处的Asn通过水介导的氢键与环糊精相结合,当突变成带负电荷的Glu、Asp或者疏水性的Ile时,氢键被破坏,产物抑制降低,而突变成Lys、His和Arg后,侧链氨基的存在仍导致氢键的存在,甚至更强,产物抑制更严重。(4)在前面基础上,对β-CGT酶设计了2个双突变体(N603D/L600R和N603D/L600E)和片段替换突变体(MBS2-Bc DF9R)进行进一步研究。结果发现,N603D/L600R和N603D/L600E以及MBS2-Bc DF9R均具有更好的产物抑制降低效果。当以5%麦芽糊精(DE=4)为底物进行环糊精生产时,在相同酶蛋白添加量下,双突变体N603D/L600R和N603D/L600E的主产物β-环糊精比野生型分别高出43.7%和27.9%,具有潜在的工业应用价值。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶环糊精产物抑制麦芽糖基结合位点2 突变

大豆脂氧酶好氧催化的研究——高底物浓度下底物抑制及产物抑制的松驰研究

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大豆脂氧酶好氧催化的研究——高底物浓度下底物抑制及产物抑制的...

作者：苏亚芬江南大学

学位级别：硕士

脂氧酶(LOX)的结构中含有非血红素铁,能专一催化具有cis,cis-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧形成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物(HPOD)。本文研究了经溶剂工程改造后优化大豆脂氧酶好氧催化亚油酸的工艺条件,探索反应过程中底... 详细信息

脂氧酶(LOX)的结构中含有非血红素铁,能专一催化具有cis,cis-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧形成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物(HPOD)。本文研究了经溶剂工程改造后优化大豆脂氧酶好氧催化亚油酸的工艺条件,探索反应过程中底物抑制和产物抑制的松弛因子并考察了外源Cu(Ⅱ)与脂氧酶中心Fe(Ⅱ)的相互作用,得出如下主要结论: 1、溶剂DMF的加入可增大底物的溶解性,避免高底物浓度引起的黏度问题,而且可提高底物与酶的互溶性。先用单因素法确定经溶剂工程改造后酶促反应的适宜工艺条件,然后以纯亚油酸(LA)为底物,采用正交法对工艺进一步调优,得到的优化工艺条件为:10C,pH9,氧气流量为15 mL/min,搅拌线速度5.02 m/s,DMF量为4%(V/V),底物浓度为90-100g/L,酶浓度4.74×10U/mL,阻聚剂浓度为0.02g/L,柠檬酸钠含量为体系的1%。在此条件下,取底物浓度90g/L(有效底物86.40g/L:亚油酸78.30g/L,亚麻酸8.10g/L),以东北新大豆为酶源时,HPLC分析HPOD结果无原料及副产物峰,该结果与二甲酚橙法测定结果97.0%基本一致,所得13-与9-HPOD异构体的比例为1.9:1。 2、大豆脂氧酶催化亚油酸的氢过氧化反应在底物浓度≥0.075 mmol/L时便产生底物抑制作用。选用logP为-0.81的稀释剂DMF可将底物浓度提升到232 mmol/L并使HPOD产率从38.93%提高到66.09%。冻干实验表明,在底物存在下,DMF对酶几乎无损伤,酶活基本保持不变;对DMF的激活常数K、抑制常数K及DMF与底物对酶活的综合影响的分析表明,低浓度DMF与自由酶的相互作用为竞争性激活,高浓度时为竞争性抑制。高浓度DMF的底物抑制常数K比空白增大了1000～5600倍,说明DMF松弛底物抑制与竞争性抑制脂氧酶的综合作用使得底物抑制作用大大松弛。实验发现DMF浓度为5%的体系具有最大的K与K值,说明此浓度下DMF对底物抑制作用的松弛效应最强而对酶的抑制作用相对最小。 3、在经溶剂工程(DMF)改造的LOX催化高浓度底物LA的氢过氧化反应体系中,电解质对高浓度底物LA体系的参与机制不能仅用传统的两类位点的竞争机制予以解释,需要综合考虑以下三要素(1)电解质调节两类位点对LA竞争吸附的共性作用;(2)电解质对LOX的共性激活和特性激活作用;(3)电解质微调LOX-LA-DMF结合状态的共性作用等。虽然(1)和(2)的作用随着电解质浓度增加而单调增强,但(3)的作用

关键词：大豆脂氧酶酶催化亚油酸氢过氧化物底物抑制产物抑制松弛相互作用

利用定点突变减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的研究

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利用定点突变减弱环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的研究

作者：徐琪江南大学

学位级别：硕士

环糊精(Cyclodextrin,简称CD)具有独特的“内疏水、外亲水”的空腔结构,使其能够包合很多客体分子,因此可以广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。同时,环糊精工业化生产所必须的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.***.1.19,简称CGT酶)也成为了... 详细信息

环糊精(Cyclodextrin,简称CD)具有独特的“内疏水、外亲水”的空腔结构,使其能够包合很多客体分子,因此可以广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。同时,环糊精工业化生产所必须的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.***.1.19,简称CGT酶)也成为了当今的研究热点。在环糊精酶法合成过程中,当反应体系中环糊精达到一定浓度后,环糊精分子会与CGT酶分子发生结合,酶所催化的环化反应因此受到抑制,导致反应体系中环糊精浓度不再增加,淀粉转化率较低,环糊精生产成本居高不下,因此,有效控制酶反应过程中的产物抑制显得至关重要。本论文首先研究了环糊精对两种类型CGT酶(来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGT酶和来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶)所催化环化反应的抑制作用,了解了不同类型环糊精对CGT酶的抑制规律;考虑到目前工业生产和应用最广泛的是β-环糊精,下一步主要采用定点突变技术构建了来源于B.circulans STB01的β-CGT酶突变体,以减弱主要产物—β-环糊精的抑制作用;最后,将构建的突变体应用于β-环糊精生产,确定了能有效降低产物抑制、提高β-环糊精得率的酶突变体。主要研究结果如下:(1)以麦芽糊精(DE 5)为底物时,CGT酶的环化反应动力学性质能用米氏方程进行描述。在底物中加入环糊精,分析CGT酶环化反应抑制动力学性质,结果显示,环糊精对两种类型CGT酶所催化的环化反应有着不同的抑制作用。α-、β-和γ-环糊精对来源于P.macerans JFB05-01的α-CGT酶均为竞争性抑制,而对来源于B.circulans STB01的β-CGT酶均为线性混合型抑制,说明环糊精对不同类型CGT酶的抑制作用存在明显差异,而不同环糊精对同一种酶的抑制类型相同。而且,每种类型环糊精对其所对应的环化活力抑制作用最强,如β-环糊精对两种类型CGT酶的β-环化活力抑制作用最强。(2)将来源于B.circulans STB01的β-CGT酶的麦芽糖基结合位点2处的氨基酸残基进行突变,构建了五种酶突变体,并进一步分析了酶突变体的酶动力学性质和β-环糊精对酶突变体环化活力的抑制作用。结果显示,相比于野生β-CGT酶,β-环糊精对酶突变体A599N、A599V、A599N/Y633A、A599V/Y633A和MBS2(将麦芽糖基结合位点2处的氨基酸残基全部替换成来源于P.macerans JFB05-01的α-CGT酶中所对应的氨基酸残基)的非竞争性抑制显著减弱,主要体现在非竞争性抑制常数增加2-4倍,而竞争性抑制也有一定程度的减弱。通过晶体结构模拟发现,产物抑制减弱的原因可能是突变弱化了β-环糊精与酶麦芽糖基结合位点2处氨基酸残基之间的氢键和范德华作用力,从而降低了β-环糊精与酶分子之间的结合作用。与此同时,突变也对β-CGT酶的环化活力、催化效率有一定影响。相比野生β-CGT酶,A599N、A599V的总环化活力分别降低了15.6%和76.8%,A599V/Y633A总环化活力下降了70.1%,而A599N/Y633A总环化活力增加了22.4%,MBS2的总环化活力增加了4.3%。突变均导致了酶催化效率(Kcat/Km)的降低,其中A599V和A599V/Y633A的催化效率下降最为明显,催化效率分别只有野生型酶的23.3%和9.8%;A599N和A599N/Y633A的催化效率有所下降,催化效率分别为野生型酶的64.7%和31.6%;MBS2催化效率仅略微下降,催化效率为野生型酶的98%。从酶的一级结构分析,这可能是由于单、双突变使β-CGT酶与底物的结合作用减弱所致。此外,突变对β-CGT酶的热稳定性和产物特异性并无显著影响。(3)将具有较低产物抑制的β-CGT酶突变体A599N、A599V、A599N/Y633A、A599V/Y633A和MBS2应用于β-环糊精的生产,结果显示,当以5%(w/v)可溶性淀粉为底物且不添加有机溶剂作为复合剂时,相比于野生β-CGT酶,突变体A599N、A599N/Y633A和MBS2均能明显提高β-环糊精得率,分别提高了13.1%、15.8%和19.7%。当以20%(w/v)普通玉米淀粉为底物且添加环己烷作为复合剂时,突变体A599N、A599N/Y633A不能提高β-环糊精的得率,而突变体MBS2能提高β-环糊精得率15.6%,因此,相比于野生β-CGT酶,突变体MBS2更适合β-环糊精的工业化生产。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶环糊精产物抑制麦芽糖基结合位点定点突变

1,3-丙二醇发酵中甘油代谢及产物抑制作用

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生物加工过程 2007年第4期5卷 5-8页

作者：李凤梅白皓然李文香刘长江青岛农业大学食品科学与工程学院青岛266109 沈阳农业大学食品学院沈阳110161

对微生物法甘油转化成1,3-丙二醇过程中代谢规律及代谢控制的相关酶作以简述,并着重分析了丁酸梭菌发酵生产中乙酸、丁酸等副产物对细胞的抑制作用,对未来的研究发展方向进行了展望。

关键词：甘油代谢丁酸梭菌 1 3-丙二醇产物抑制

用农作物秸秆高效生物合成人造淀粉和单细胞蛋白

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Science Bulletin 2023年第2期68卷 214-223,M0004页

作者：徐欣欣张伟游淳范超纪王莉 Jong-Tae Park Jiyun Kwak 陈红歌张以恒马延和 Key Laboratory of Engineering Biology for Low-Carbon Manufacturing Tianjin Institute of Industrial BiotechnologyChinese Academy of SciencesTianjin 300308China Biotechnology Research Institute Chinese Academy of Agricultural SciencesBeijing 100081China Department of Food Science and Technology Chungnam National UniversityDaejeon 34134Republic of Korea College of Life Sciences Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450002China

全球人口快速增长和气候变化正在引发可能的粮食危机.本研究开发了一种利用现有且丰富的农业废弃物(秸秆)高效合成人造淀粉和微生物蛋白的新技术.利用没有辅酶的体外多酶分子机器和酿酒酵母进行一锅法生物转化,将预处理玉米秸秆中的纤... 详细信息

全球人口快速增长和气候变化正在引发可能的粮食危机.本研究开发了一种利用现有且丰富的农业废弃物(秸秆)高效合成人造淀粉和微生物蛋白的新技术.利用没有辅酶的体外多酶分子机器和酿酒酵母进行一锅法生物转化,将预处理玉米秸秆中的纤维素进行酶水解合成人造淀粉,同时在有氧条件下发酵生产微生物蛋白.低成本去除β-葡萄糖糖苷酶的商业化纤维素酶以及在酿酒酵母细胞表面展示骨架蛋白用于固定淀粉磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶,构成一个多酶分子机器与酵母的复合体系,从而实现稀酸预处理秸秆的高效纤维素水解;利用纤维素水解中间产物的底物穿梭效应(从纤维素到微生物),快速消除葡萄糖对纤维素酶的产物抑制,比富含商业β-葡萄糖苷酶的纤维素酶混合物表现出更好的纤维素水解速率.动物实验结果显示,人造直链淀粉摄入引起缓慢平缓的血糖水平变化,表明直链淀粉作为预防肥胖和糖尿病的健康食品的应用前景.利用农业废弃物资源高效生物合成人造淀粉和微生物蛋白是解决粮食危机,实现农业可持续发展的重要途径之一.

关键词：直链淀粉微生物蛋白产物抑制纤维素水解淀粉磷酸化酶粮食危机动物实验结果单细胞蛋白

用放射化学酶环氧化酶-1和环氧化酶-2体外检测天然产物抑制前列腺素生物合成的活性

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现代药物与临床 1999年第2期14卷 78-79页

作者：苑可武

环氧化酶-1(COX-1)是合成前列腺素的催化剂,目前已广泛用于植物提取物和植物成分抗炎作用的研究。COX-2是一种炎症介质诱导产生的酶。目前普遍认为传统的非甾体抗炎药,如阿司匹林、吲哚美辛等的副作用

关键词：环氧化酶产物抑制前列腺素女用避孕药生物合成生化反应天然