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产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定

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中国预防兽医学报 2013年第6期35卷 500-503页

作者：王超唐丽杰葛俊伟乔薪媛崔文姜艳萍李一经东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

为研究突变产气荚膜梭菌ε毒素(mε)的抗体是否具有中和作用,本研究以毒素D型产气荚膜梭菌全基因组D N A为模板,应用重叠延伸PCR技术(SO E-PCR)将ε毒素第106位的组氨酸残基定点突变为脯氨酸残基,扩增出mε基因,使其丧失生物学毒性而保... 详细信息

为研究突变产气荚膜梭菌ε毒素(mε)的抗体是否具有中和作用,本研究以毒素D型产气荚膜梭菌全基因组D N A为模板,应用重叠延伸PCR技术(SO E-PCR)将ε毒素第106位的组氨酸残基定点突变为脯氨酸残基,扩增出mε基因,使其丧失生物学毒性而保持免疫原性。以pET-28a为表达载体,构建重组表达质粒pET-mε,并转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达重组mε蛋白。SDS-PAGE及w estern blot分析显示,重组蛋白约39 ku,主要以包涵体形式存在。将重组蛋白免疫家兔,所制备的产气荚膜梭菌mε毒素蛋白的抗血清经10倍稀释后,与一个绝对致死量的产气荚膜梭菌培养上清等体积混合时,能够有效中和ε毒素。这些结果表明,重组突变的ε毒素具有较强的抗原性,为产气荚膜梭菌候选亚单位疫苗的研究及其血清学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素突变基因大肠杆菌表达抗体中和效价

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产气荚膜梭菌ε毒素受体研究进展

动物医学进展 2020年第5期41卷 100-104页

作者：耿志军辛文文黄静康琳袁媛王景林安徽医科大学安徽合肥230032 解放军军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

产气荚膜梭菌是产生多种毒素的厌氧菌,在人类和动物中引起多种疾病。其中一种毒素ε毒素(ETX)能诱导山羊、绵羊和牛的致命肠道疾病。ETX属于成孔毒素,含有3个不同的结构域,通过蛋白水解活化及脂筏相关蛋白在细胞表面形成寡聚孔。ETX被... 详细信息

产气荚膜梭菌是产生多种毒素的厌氧菌,在人类和动物中引起多种疾病。其中一种毒素ε毒素(ETX)能诱导山羊、绵羊和牛的致命肠道疾病。ETX属于成孔毒素,含有3个不同的结构域,通过蛋白水解活化及脂筏相关蛋白在细胞表面形成寡聚孔。ETX被美国疾病控制和预防中心(CDC)列为B类生物恐怖战剂,其毒力仅次于肉毒毒素和破伤风神经毒素。ETX能与其靶细胞膜受体特异性结合,但是其受体尚未确定,故论文就其受体研究的相关进展进行综述,为研究产气荚膜梭菌ε毒素诱导疾病的防治提供重要靶标。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素去污剂抗性膜甲型肝炎病毒细胞受体1 小窝蛋白髓鞘和淋巴细胞蛋白

产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组乳酸杆菌的构建及其免疫学评价

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产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组乳酸杆菌的构建及其免疫学评价

作者：王超东北农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是广泛存在自然界的一种常见的条件性致病菌,能够引起动物产生坏死性肠炎、肠毒血症等,同时也是导致人类食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。按毒素型分类,可将其分为A、B、C、D、E五个... 详细信息

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是广泛存在自然界的一种常见的条件性致病菌,能够引起动物产生坏死性肠炎、肠毒血症等,同时也是导致人类食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。按毒素型分类,可将其分为A、B、C、D、E五个型,目前,已发现的外毒素至少有13种,其中α、β、ε和ι是主要的外毒素。ε毒素由B型和D型产气荚膜梭菌所产生,是D型产气荚膜梭菌的主要毒素,同时也是一种孔毒素,对MDCK（犬肾细胞）具有致死作用。为研究突变的产气荚膜梭菌ε毒素（mε）的抗体是否具有中和作用,本研究以毒素D型产气荚膜梭菌全基因组DNA为模板,应用重叠延伸PCR技术（SOE-PCR）将ε毒素第106位的组氨酸残基定点突变成脯氨酸残基,扩增出mε基因,使其丧失生物学毒性而保持其免疫原性。以pET-28a作为表达载体,构建了重组表达质粒pET-mε,并转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达重组mε毒素蛋白,SDS-PAGE及western blot分析显示,表达的重组蛋白大小约39ku,主要以包涵体形式存在。将重组蛋白免疫家兔,所制备的产气荚膜梭菌mε毒素蛋白的抗血清经10倍稀释后,与2倍最小致死量（MLD）的产气荚膜梭菌培养上清等体积混合时,能够有效中和ε毒素。这些结果表明,重组突变的ε毒素具有较强的抗原性,这为产气荚膜梭菌候选亚单位疫苗的研究及其血清学诊断方法的建立奠定了基础。根据乳酸杆菌密码子使用的偏爱性,对ε毒素突变基因进行了优化并合成。以pPG-2作为其表达载体,构建了重组表达质粒pPG-2-ms,并电转化至戊糖乳杆菌L. pentosus及干酪乳杆菌***’中,成功构建重组戊糖乳杆菌pPG-2-mε/L. pentosus及重组干酪乳杆菌pPG-2-mε/L. pentosus。将构建的两种重组乳酸杆菌通过1%乳糖诱导进行目的蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示,均有大小约39ku的融合蛋白表达,所表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot鉴定结果表明,这两种重组菌表达的蛋白均可被产气荚膜梭菌ε毒素兔抗血清所识别,证实了ε毒素在两种乳酸杆菌中确实得到了表达。为探讨表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的重组戊糖乳杆菌系统及重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,本实验以BALB/c小鼠作为实验动物,进行口服免疫实验。实验组Ⅰ口服重组戊糖乳杆菌,实验组Ⅱ口服干酪乳杆菌,实验组Ⅲ口服PBS作为对照。共免疫三次,每隔2w免疫一次,每次连续免疫3d。免疫后分别测定各组小鼠在第4、5、6、8、10、12、18、19、20、22、24、26、32、33、34、36、38、40d时的粪便、鼻腔冲洗液及阴道冲洗液中抗ε毒素的特异性slgA水平以及血清中抗ε毒素的特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,经口服免疫重组戊糖乳杆菌及重组干酪乳杆菌的小鼠,在其粪便、鼻腔冲洗液及阴道冲洗液中均检测到了特异性slgA抗体,并在其血清中也检测到了较高水平的特异性IgG抗体。这表明重组戊糖乳杆菌系统及重组干酪乳杆菌能够有效刺激机体产生局部黏膜免疫应答和体液免疫应答。重组乳酸菌免疫小鼠的攻毒试验结果表明,两种重组乳酸杆菌免疫小鼠均能对小鼠产生一定的免疫保护作用,其中重组干酪乳杆菌的效果要好于重组戊糖乳杆菌。本研究首次构建了重组产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的戊糖乳杆菌及干酪乳杆菌分泌表达系统,并产生良好的免疫效果,为产气荚膜梭菌ε毒素口服疫苗的研制以及疾病的诊断防治奠定了坚实的基础。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素突变基因乳酸杆菌

无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

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中国农业科学 2018年第11期51卷 2206-2215页

作者：杜吉革薛麒朱真李启红印春生姚文生康凯陈小云中国兽医药品监察所牛羊病实验室

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和... 详细信息

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX;。将GETX;克隆至原核表达载体p ET30a-（+）后,将p ET30a-GETX;转化至BL21（DE3）感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白r ETX;。利用Western blot方法,检测r ETX;与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将r ETX;用细胞维持液稀释至100及10μg·m L;,检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的r ETX;,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg;3个剂量尾静脉注射,检测r ETX;对小鼠的毒力。随后,将r ETX;与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次（间隔两周）,100μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测r ETX;对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件,r ETX;在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性r ETX;。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,r ETX;可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别r ETX;,出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在r ETX;浓度为100μg·m L;的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg;剂量的r ETX;,对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,r ETX;免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450—750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500—4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌r ETX;毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素突变重组表达毒力抗原性

产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

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中国兽药杂志 2018年第6期52卷 13-20页

作者：杜吉革彭小兵张秀坤朱真薛麒王磊李启红印春生姚文生康凯蒋玉文陈小云中国兽医药品监察所北京100081

为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),... 详细信息

为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白r ETXH106P。利用Western blot方法检测r ETXH106P与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将r ETXH106P与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,r ETXH106P为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100μg/m L的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×106ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌r ETXH106P重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素突变重组表达毒力抗原性

产气荚膜梭菌ε毒素的细胞毒机制及致病机理的研究进展

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辽宁师范大学学报（自然科学版） 2015年第2期38卷 219-224页

作者：李庆伟石碧玥韩英伦刘欣辽宁师范大学生命科学学院七鳃鳗研究中心辽宁大连116081

产气荚膜梭菌ε毒素(Epsilon toxin,ETX)由B、D型产气荚膜梭菌产生并分泌至宿主动物体内,在临床上主要症状为肠毒血症.ETX属于以七聚体形式存在的β-样成孔毒素,它能够形成由14个β折叠片组成的"β-桶状"结构,这个"β-桶状"结构可以插... 详细信息

产气荚膜梭菌ε毒素(Epsilon toxin,ETX)由B、D型产气荚膜梭菌产生并分泌至宿主动物体内,在临床上主要症状为肠毒血症.ETX属于以七聚体形式存在的β-样成孔毒素,它能够形成由14个β折叠片组成的"β-桶状"结构,这个"β-桶状"结构可以插入真核细胞的质膜形成穿孔.在细胞水平,ETX能够迅速使细胞膜肿胀、多种细胞器破坏,最终导致靶细胞的坏死.在哺乳动物体内,ETX能够使哺乳动物血管产生水肿,从而穿透血脑屏障而聚积在动物肾和脑中,导致机体随着谷氨酸盐的释放而产生过度兴奋,这一系列反应的发生可以引起机体出现脑水肿和肾衰竭,最终导致动物的死亡.目前,ETX备受关注的主要原因不仅仅因为它是一种β-样成孔毒素,而是可以作为潜在的一种工具类药物,经改造后可以携带治疗药物在短时间内靶向性地到达哺乳动物脑和中枢神经系统,继而为脑和中枢神经系统疾病的治疗提供新的方向.结合国内外相关研究,对ETX细胞毒机制及致病机理进行了综和评述.

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素细胞毒作用机制致病机理产气荚膜梭菌

一种基于PLGA纳米颗粒的产气荚膜梭菌ε毒素可溶性微针疫苗

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一种基于PLGA纳米颗粒的产气荚膜梭菌ε毒素可溶性微针疫苗

作者：万伟北京化工大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌ε毒素(Clostridium perfringens epsilon toxin,ETX)毒性仅次于肉毒毒素和破伤风毒素,会引起哺乳动物的肠毒血症,坏死性肠炎和神经系统疾病等。其中毒后仅凭药物治疗很难达到效果,接种疫苗是预防此类疾病的重要方法。本研... 详细信息

产气荚膜梭菌ε毒素(Clostridium perfringens epsilon toxin,ETX)毒性仅次于肉毒毒素和破伤风毒素,会引起哺乳动物的肠毒血症,坏死性肠炎和神经系统疾病等。其中毒后仅凭药物治疗很难达到效果,接种疫苗是预防此类疾病的重要方法。本研究旨在开发一种基于PLGA纳米颗粒疫苗佐剂的新型微针贴片用于递送r ETX–C疫苗以增强免疫反应。具体研究内容如下:(1)PLGA纳米颗粒的制备。选择FDA批准的安全性高的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)成功制备纳米颗粒(Nanoparticle,NP),通过引入双十八烷基二甲基溴化铵(Dimethyldioctadecylammonium bromide,DDAB)使PLGA NPs表面呈正电性以吸附抗原。对其形貌、粒径大小、ZETA电位、细胞毒性以及DDAB的加入量进行考察。结果显示,成功制备出表面光滑、粒径为100∽200nm、分散性良好、表面呈正电且安全性良好的PLGA NPs,可温和高效吸附减毒突变体蛋白r ETX-C。(2)PLGA-DDAB可溶性微针疫苗的制备。选择鱼明胶与蔗糖作为微针基质制备可溶性微针疫苗。对其形貌、力学性能、小鼠皮肤刺入性以及体内释放时间进行考察。结果显示,PLGA-DDAB可溶性微针疫苗贴片针尖完整、机械性能良好,PLGA NPs携载抗原集中于针尖以实现准确定量递送。光学断层相干扫描技术(Optical coherencetomography,OCT)结果表明PLGA-DDAB可溶性微针在拇指按压力下可以顺利刺入猪皮,并在10∽15 min内可以完全溶解在皮肤内。小鼠体内释放时间研究显示PLGA能够在注射部位形成短期的抗原储库,具有一定的缓释作用。(3)PLGA-DDAB可溶性微针疫苗的免疫原性及保护效果评价。PLGA NPs可提高细胞免疫与体液免疫双应答,三免后特异性Ig G抗体滴度达到10,提高了Ig G2a/Ig G1的比例,并有效激活T细胞与IL-2、IL-4、IL-6及γ-干扰素等细胞因子的表达。微针能够增强免疫应答并产生更多的中和抗体,体内中和实验表明微针免疫相较于皮下免疫具有更好的保护效果,体外中和实验表明微针免疫对小鼠与MDCK细胞产生的保护效果明显优于皮下免疫组。此外,两种不同免疫方式与PLGA NPs联合使用时均能产生100%的保护效果。综上,我们基于PLGA NPs制备的可溶性微针疫苗贴片既具有接种快速简便、无痛、热稳定性好等微针疫苗贴片的优势,又具有PLGA NPs增强免疫效果的特点,且制备方法简单、安全有效、便于后续的批量生产。它为预防ETX中毒,降低ETX中毒引起的畜牧业损失,以及防范ETX作为生物恐怖剂带来的生物安全威胁提供了有效手段,并有望成为一种新的疫苗递送系统拓展到其他疫苗或药物。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素 PLGA纳米颗粒疫苗佐剂可溶性微针

膜伪装仿生纳米颗粒用于治疗产气荚膜梭菌ε毒素中毒的研究

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膜伪装仿生纳米颗粒用于治疗产气荚膜梭菌ε毒素中毒的研究

作者：徐靖淋河北师范大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)为革兰氏阳性菌,在自然界中分布广泛,主要存在于动物肠道中,是一种典型的人兽共患病病原体。目前已发现其可以产生超过十七种外毒素,其中产气荚膜梭菌ε毒素(Clostridium perfringensε-toxin,ETX... 详细信息

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)为革兰氏阳性菌,在自然界中分布广泛,主要存在于动物肠道中,是一种典型的人兽共患病病原体。目前已发现其可以产生超过十七种外毒素,其中产气荚膜梭菌ε毒素(Clostridium perfringensε-toxin,ETX)是迄今为止已发现的产气荚膜梭菌外毒素中最为致命的毒素之一。ETX是主要由B型和D型产气荚膜梭菌产生的致病因子,也是导致绵羊和山羊肠毒素血症的主要毒素。由ETX引起的疾病具有发病急、缺乏特效药、致死快的特点,给畜牧业造成了严重的经济损失。另外,由于ETX具有的高毒性,其也被视为潜在的生物战剂和生物恐怖剂,我国也将其列入了生物两用品进出口管制清单。因此,开展ETX治疗药物的研究对生物安全和社会稳定具有极高的价值。近年来,纳米技术飞速发展,在医学领域的应用愈加广泛。其中膜伪装仿生纳米颗粒(Membrane-camouflaged biomimetic nanoparticles,MNPs),直接利用天然衍生的细胞膜赋予纳米粒子增强的生物界面。纳米颗粒表面包裹的细胞膜能够将其来源细胞表面的大部分生物信息与功能复制到纳米颗粒表面。这一手段不仅能使纳米颗粒具有良好的生物相容性和更长的体内循环时间,还能使纳米颗粒表面具备来源细胞膜所具有的大部分生物功能,从而使纳米颗粒能够被赋予更广泛、更复杂的诊断治疗功能。利用ETX毒素可以在细胞膜上成孔的特点,采用ETX敏感细胞的细胞膜包裹聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米颗粒,制备得到的MNPs可作为长循环药物,中和动物体内的ETX毒素,从而用于致命ETX毒素中毒的治疗。本研究首先利用大肠杆菌表达系统表达了N端带有GST标签的重组ETX毒素(GST-ETX),经过GST标签亲和纯化柱纯化,将所得蛋白超滤浓缩后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定了纯化后蛋白的纯度,并通过BCA法测定其浓度,稀释至合适浓度后保存于4℃或-20℃备用。其次通过乳化溶剂蒸发法制备PLGA纳米颗粒,并通过优化组分比例,制备得到了符合预期的直径在100 nm左右的纳米颗粒,通过差速离心法分离不同大小的颗粒。提取犬肾上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)以及成熟人红细胞(Red blood cells,RBC)的细胞膜,分别通过机械挤压方式使其包裹在上述PLGA纳米颗粒表面。使用纳米流式仪(Flow Nano Analyzer)、动态光散射仪(Dynamic Light Scattering,DLS)和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)对所得纳米颗粒和膜伪装纳米颗粒的物理性质进行表征。然后利用MDCK细胞模型和RBC模型,通过细胞活性检测(MTS法)和红细胞溶血实验,分别评价GST-ETX、聚合物纳米颗粒(Polymeric Nanoparticles,NPs)和两种MNPs的体外细胞毒性、体外溶血活性。同时,利用MDCK细胞模型和RBC模型分别评价两种MNPs体外中和GST-ETX并保护敏感细胞的能力。并通过高内涵成像系统,检验两种MNPs体外保护MDCK细胞的能力。最后以BALB/c小鼠为动物模型,分别评价GST-ETX、NPs和两种MNPs的动物毒性,并基于两种MNPs的安全性对其进行选择。之后以BALB/c小鼠为动物模型,通过治疗实验、血液生化分析以及病理组织学方法评价MNPs在小鼠体内治疗ETX中毒的能力。通过动物组织体外成像实验验证MNPs与GST-ETX在小鼠体内的代谢及相互作用。而后使用上述实验方法,分别评价静脉注射和肺递送MNPs对小鼠吸入性ETX中毒的治疗效果能力,以及提前注射或吸入MNPs为小鼠短期预防ETX中毒的能力。本研究成功表达并获得了高纯度的GST-ETX,其毒性与天然ETX毒性相当。通过优化制备方案,成功制备了直径在100 nm左右且大小均一的PLGA纳米颗粒。通过提取不同来源的细胞膜,包裹在PLGA颗粒上制备了两种不同的MNPs,并且获得了两种MNPs的物理表征参数。体外评价结果表明红细胞和MDCK包裹的MNPs通过中和环境中的ETX,可以保护细胞抵抗完全致死浓度ETX的攻击,MDCK-MNPs的保护效果优于红细胞-MNPs的保护效果,其保护能力的高低与膜来源细胞对ETX的敏感程度正相关。在本研究后续的两种MNPs的体内安全性评中,与来自有核细胞的细胞膜(如MDCK细胞)相比,更简单的细胞(如RBC)的细胞膜不会诱导动物产生任何免疫反应,使得用相应的细胞膜伪装的纳米颗粒在安全性方面具有优势,MDCK细胞膜能引起小鼠的超敏反应导致部分小鼠死亡。在MNPs的动物治

关键词：膜伪装仿生纳米颗粒产气荚膜梭菌ε毒素纳米药物吸入式药物长循环药物

重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析

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中国兽药杂志 2018年第7期52卷 28-34页

作者：杜吉革张秀坤朱真薛麒李启红印春生彭小兵王磊姚文生康凯陈小云中国兽医药品监察所北京100081

为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端... 详细信息

为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNETXm3。随后,将该基因片段克隆至原核表达载体p ET30a-(+),转染BL21(DE3)菌诱导表达、纯化,从而获得重组蛋白,进而利用Western blot方法检测重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)及小鼠的毒力。最后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果显示,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,且能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;100μg/m L的重组蛋白未显示细胞毒性;6.25 mg/kg剂量的重组蛋白对小鼠无致死性;每毫升的一免抗血清可中和80~120个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和750~1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。试验表明,产气荚膜梭菌ETX三点突变体的毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

关键词：产气荚膜梭菌ε毒素突变体 Th细胞表位鞭毛蛋白抗原性