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解甘露醇罗尔斯顿菌的耐药性和原卟啉亚铁螯合酶毒力因子研究

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浙江大学学报（医学版） 2017年第4期46卷 413-420页

作者：葛玉梅陈学波黄燕颖吕火烊赵钊周永列杭州医学院附属人民医院浙江省人民医院临床医学检验中心浙江杭州310014 温州医科大学检验医学院浙江温州325035

目的:检测与分析解甘露醇罗尔斯顿菌的耐药性和β-内酰胺酶基因、原卟啉亚铁螯合酶基因及其结构和功能。方法:采用血平板分离划线培养、全自动细菌检测分析系统和16S RNA基因PCR分离并鉴定病原菌。采用微量稀释法对分离菌株进行药敏试验... 详细信息

目的:检测与分析解甘露醇罗尔斯顿菌的耐药性和β-内酰胺酶基因、原卟啉亚铁螯合酶基因及其结构和功能。方法:采用血平板分离划线培养、全自动细菌检测分析系统和16S RNA基因PCR分离并鉴定病原菌。采用微量稀释法对分离菌株进行药敏试验,β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶和碳青酶烯酶确证试验确定其产酶情况。采用PCR扩增分离菌株5个β-内酰胺酶基因和原卟啉亚铁螯合酶基因并测序。采用生物信息学软件分析该原卟啉亚铁螯合酶基因产物结构与功能。结果:患者血液中分离出解甘露醇罗尔斯顿菌。该菌株对头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、替加环素敏感,但对五种青霉素类、四种头孢菌素类和两种碳青酶烯类抗菌药物耐药。该菌株产β-内酰胺酶但不产超广谱β-内酰胺酶和碳青酶烯酶。该菌株具有5个独特的β-内酰胺酶基因和原卟啉亚铁螯合酶基因,该基因产物为含2个Ⅱ类螯合酶超家族原卟啉亚铁螯合酶功能结构域,与脑膜炎奈瑟菌原卟啉亚铁螯合酶亲缘关系最近。结论:该株解甘露醇罗尔斯顿菌对β-内酰胺类抗菌药物有较高耐药性,其β-内酰胺酶基因与常见细菌β-内酰胺酶基因不同,原卟啉亚铁螯合酶可能是其重要毒力因子。

关键词：抗药性微生物 β内酰胺酶类变异(遗传学) 亚铁螯合酶原卟啉类基因毒力因子类

红细胞生成性原卟啉病一家系亚铁螯合酶基因突变检测

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中华皮肤科杂志 2010年第2期43卷 85-87页

作者：马俊红肖生祥安金刚王晓鹏许庆强董颖颖冯义国西安交通大学第二附属医院皮肤科 710004

目的通过对一例红细胞生成性原卟啉病家系亚铁螯合酶基因突变检测，探讨红细胞生成性原卟啉病的遗传特征。方法收集一例红细胞生成性原卟啉病家系中4例患者及3例表型正常者和50例无亲缘关系健康个体外周血标本，采用PCR扩增亚铁螯合酶... 详细信息

目的通过对一例红细胞生成性原卟啉病家系亚铁螯合酶基因突变检测，探讨红细胞生成性原卟啉病的遗传特征。方法收集一例红细胞生成性原卟啉病家系中4例患者及3例表型正常者和50例无亲缘关系健康个体外周血标本，采用PCR扩增亚铁螯合酶基因全部11个外显子及侧翼序列并进行直接测序。结果先证者及其母亲、姐姐、表兄、外祖父中检测到一个新的剪接突变位点间隔序列（IVS）3＋1G—A，其外祖母和父亲未发现该突变；正常对照未发现此突变。先证者及其父亲、姐姐、表兄、外祖父两个单核苷酸多态性为IVS1—23T／C和IVS3—48C／T，而先证者的母亲与外祖母为IVS1—23C／C和IVS3—48T／T。结论发现红细胞生成性原卟啉病家系一个新的基因突变位点，该突变可能与两个低表达等位基因IVS1—23T和IVS3—48C共同导致红细胞生成性原卟啉病的临床表型。

关键词：原卟啉病,红细胞生成性亚铁螯合酶突变

红细胞生成性原卟啉病一家系中亚铁螯合酶基因突变的检测

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中华皮肤科杂志 2009年第8期42卷 569-571页

作者：周少娜彭振辉肖生祥李晓莉刘艳李伯埙西安交通大学第二附属医院皮肤科 710004

目的对一红细胞生成性原卟啉病（EPP）家系进行基因突变研究，探讨基因突变与临床表现的关系，为进一步开展基因诊断和基因治疗奠定基础。方法收集家系资料，抽取家系中患者、正常人及与该家系无关的50例正常人的外周血，提取外周血基因... 详细信息

目的对一红细胞生成性原卟啉病（EPP）家系进行基因突变研究，探讨基因突变与临床表现的关系，为进一步开展基因诊断和基因治疗奠定基础。方法收集家系资料，抽取家系中患者、正常人及与该家系无关的50例正常人的外周血，提取外周血基因组DNA。应用PCR方法扩增外周血基因组DNA亚铁螯合酶（FECH）基因的第1至11外显子及其侧翼序列。PCR产物直接进行双向测序以检测突变。结果根据临床表现和卟啉测定结果，患者明确诊断为红细胞生成性原卟啉病。PCR扩增得到预期DNA片段。PCR产物直接测序结果：家系中先证者、其妹和其父FECH基因第1内含子供体剪接位点检测到一个杂合突变（IVS1＋1G→C），该突变为国际首次报道。还在先证者、其妹和其母FECH基因第1内含子受体端检测到一个与低表达等位基因相关的多态性（IVS1—23C／T）。结论报道一FECH基因第1内含子供体剪接位点的新突变，该突变可能引发FECH基因缺陷，是EPP家系中患者发病的分子基础。

关键词：原卟啉病,红细胞生成性亚铁螯合酶 DNA突变分析

沉默亚铁螯合酶提高胃癌细胞MGC803 5-氨基酮戊酸光动力治疗效率的初步研究

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上海医学 2018年第6期41卷 349-354页

作者：陈涛戴一扬浙江大学医学院附属第四医院消化内科浙江义乌322000

目的探索亚铁螯合酶(FECH)对胃癌细胞MGC803 5-氨基酮戊酸(5-ALA)光动力治疗(PDT)中5-ALA剂量的影响。方法在人胃癌细胞株MGC803中加入不同浓度(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol/L)5-ALA,避光培养4h,应用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细... 详细信息

目的探索亚铁螯合酶(FECH)对胃癌细胞MGC803 5-氨基酮戊酸(5-ALA)光动力治疗(PDT)中5-ALA剂量的影响。方法在人胃癌细胞株MGC803中加入不同浓度(0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol/L)5-ALA,避光培养4h,应用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞存活率。通过FECH小干扰RNA(siRNA)干扰MGC803细胞中FECH表达,优选出有较高的FECH干扰效率的FECH siRNA用于干扰实验。PDT实验设置空白组、FECH siRNA组、1.0mmol/L 5-ALA组和0.2mmol/L 5-ALA+FECH siRNA组,使用发光二极管(LED)灯照射5min,照射波长为635nm,以相应的避光组作为对照。24h后在光学显微镜下观察细胞形态,并采用CCK-8法检测活细胞率。结果加入2.0mmol/L 5-ALA的MGC803细胞存活率显著低于其余各组,差异均有统计学意义(P值均80%。经5-ALA-PDT,空白组和FECH siRNA组活细胞率均>90%;1.0mmol/L 5-ALA和0.2mmol/L 5-ALA+FECH siRNA组中活细胞率明显下降,分别为(17.13±1.63)%和(2.50±1.04)%;与1.0 mmol/L 5-ALA相比,0.2 mmol/L 5-ALA+FECH siRNA组下降的更明显(P<0.05)。结论沉默FECH能提高MGC803细胞5-ALA-PDT效率并减少5-ALA剂量,FECH是MGC803 5-ALA-PDT治疗过程中的关键因素之一。

关键词：胃肿瘤亚铁螯合酶氨基酮戊酸光动力治疗原卟啉Ⅸ

中国红细胞生成性原卟啉病一家系临床分析及亚铁螯合酶基因突变研究

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中国红细胞生成性原卟啉病一家系临床分析及亚铁螯合酶基因突变研...

作者：林晓清福建医科大学

学位级别：硕士

背景:红细胞生成性原卟啉病(EPP),是由于编码亚铁螯合酶的基因变异,导致血红素合成障碍的一种遗传病,以光敏性皮肤损伤、不同程度肝损伤、神经系统症状为特点。最常见的遗传方式是不全外显率的常染色体显性遗传,其中97.9%患者与IVS3-48... 详细信息

背景:红细胞生成性原卟啉病(EPP),是由于编码亚铁螯合酶的基因变异,导致血红素合成障碍的一种遗传病,以光敏性皮肤损伤、不同程度肝损伤、神经系统症状为特点。最常见的遗传方式是不全外显率的常染色体显性遗传,其中97.9%患者与IVS3-48C密切相关。目的:本研究通过对一例红细胞生成性原卟啉病患者及家系进行基因检测,以了解该病在家系中的遗传方式,对基因型和表现型之间的关系进行探讨,并为该家系中携带突变基因的潜在发病者提供预防建议。另对该家系中突变位点进行人群分析,扩展了中国人FECH基因突变谱,有利于遗传咨询。方法:分析先证者临床和肝组织病理特征,采集先证者家系成员及同一地区200名无关正常人外周血5ml,提取基因组DNA,采用毛细管电泳及Sanger测序方法对患者FECH基因突变位点进行检测,以了解该家系疾病遗传方式,计算突变位点基因型和等位基因频率。结果:(1)先证者的临床特征为反复出现光敏性皮肤损伤、神经系统症状和黄疸;(2)病理特征为肝脏体积无明显缩小的小结节性肝硬化,肝细胞内脂褐素沉积及肝内胆管胆栓形成;(3)在该家系中先证者及其祖母、父亲、两叔叔、胞兄检测到一缺失突变c.75761delAGAAG;在先证者及其母亲、两叔叔、一姑姑、胞兄检测到一个与低表达等位基因相关的多态性IVS3-48T>C,具有临床表型的先证者、两叔叔及胞兄同时携带有上述缺失突变及低表达等位基因;(4)另还在该家系中检测到另两种单核苷酸多态性c.921 A>G及IVS8-6162delCT;对IVS3-48T>C、c.921 A>G、IVS8-6162delCT这三种单核苷酸多态性进行人群分析,发现三者突变型等位基因频率分别为31.47%、65.40%、6.57%。结论:(1)反复发作的光敏性皮肤损伤、神经系统症状、黄疸为EPP临床特征,持续发展可导致肝硬化;(2)在该家系中发现了缺失突变c.75761delAGAAG和三种单核苷酸多态性:IVS3-48T>C、c.921 A>G及IVS8-6162delCT,其中c.75761delAGAAG、IVS8-6162delCT为国内首次报道,扩展了中国人FECH基因突变谱。(3)验证了Gouya等人关于红细胞生成性原卟啉病的遗传理论,明确了c.75761delAGAAG的致病性及IVS3-48C对EPP表型的影响。同时通过人群分析发现中国人IVS3-48C等位基因频率高于其他人种。

关键词：红细胞生成性原卟啉病亚铁螯合酶家系基因突变研究

以小干扰RNA抑制亚铁螯合酶诱导卵巢癌细胞原卟啉Ⅸ积聚的肿瘤荧光检测技术研究

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以小干扰RNA抑制亚铁螯合酶诱导卵巢癌细胞原卟啉Ⅸ积聚的肿瘤荧...

作者：姚前尹暨南大学

学位级别：硕士

目的：应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测siRNA下调FECH表达对细胞内原卟啉Ⅸ积聚的影响,以及联用小剂量ALA对PpIX产生的荧光强度的改变,探索以siRNA为基础的FECH抑制剂在肿瘤荧光成像诊断和治疗中的意义,为进一步进行体内研究和肿... 详细信息

目的：应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测siRNA下调FECH表达对细胞内原卟啉Ⅸ积聚的影响,以及联用小剂量ALA对PpIX产生的荧光强度的改变,探索以siRNA为基础的FECH抑制剂在肿瘤荧光成像诊断和治疗中的意义,为进一步进行体内研究和肿瘤的光敏治疗奠定基础。方法：1.卵巢癌HO8910PM细胞的培养;2.设计并合成靶向FECH的siRNA,用脂质体转染剂Lipofectamine 2000携带后转染HO8910PM细胞;3.用RT-PCR半定量检测细胞中FECH mRNA的表达;4.实验分：①空白对照组(未经任何处理的HO8910PM细胞)、②siRNA组、③0.1mMALA组、④0.1mM ALA+siRNA组、⑤0.5mM ALA组、⑥0.5mM ALA+siRNA组、⑦1mM ALA组、⑧1mM ALA+siRNA组、⑨正常组织上皮细胞0mMALA组空白对照、⑩正常组织上皮细胞1mM ALA+siRNA组,分别运用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜在体外检测HO8910PM细胞的荧光强度。结果：1.转染后细胞的FECH mRNA的表达水平低于未转染组,敲减效率为70.1%(vs转染剂组);2.荧光显微镜成像图显示：随ALA浓度的增高,红色荧光逐渐增强;同一ALA浓度下siRNA干扰后,其红色荧光增强;3.0. 1mMALA联合应用FECH-siRNA为能观察到特异红色荧光的最小浓度;4.②组(135.0307±7.84902)、④组(201.6248±7.36810)、⑥组(361.8257±55.79851)、⑧组(655.9286±72.31014)荧光含量值分别与①组(115.3773±4.53428)、③组(130.6456±11.54809)、⑤组(259.9907±31.33794)、⑦组(388.2075±64.03168)比较,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论：1.化学合成的靶向FECH的siRNA能够下调HO8910PM细胞中FECH基因的表达,从而增加PpIX积聚,并且与小剂量ALA联合应用具有协同效应;***联合应用FECH-siRNA使肿瘤细胞发出红光的最小浓度是0.1mM。

关键词： siRNA 亚铁螯合酶氨基酮戊酸原卟啉IX积聚卵巢癌细胞

北极来源的亚铁螯合酶基因功能研究以及Kalafungin产生菌基因组文库构建

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北极来源的亚铁螯合酶基因功能研究以及Kalafungin产生菌基因组文...

作者：陆成成华中师范大学

学位级别：硕士

自然界中微生物基因资源丰富,但可以利用的微生物基因资源依然有限,所以利用不同技术和从不同环境中挖掘微生物资源依然非常重要：(1)从极端环境挖掘微生物资源：比如极低环境,由于要适应极端恶劣的环境,极地深海沉积物中的微生物呈现... 详细信息

自然界中微生物基因资源丰富,但可以利用的微生物基因资源依然有限,所以利用不同技术和从不同环境中挖掘微生物资源依然非常重要：(1)从极端环境挖掘微生物资源：比如极低环境,由于要适应极端恶劣的环境,极地深海沉积物中的微生物呈现独特的形态学和生理学特征;所以极低微生物的基因资源成为人们研究和开发的新的热点;(2)利用新的生物技术研究已分离的微生物：链霉菌的基因组中含有大量的次级代谢产物基因簇,利用基因组挖掘技术开发抗生素合成基因现在也成为一种重要的研究趋势。本研究分为两个部分：第一部分对北极深海沉积物中的亚铁螯合酶基因进行了克隆和研究,内容包括：(1)对北极深海沉积物的宏基因组文库中目的克隆进行生物信息学分析前期对宏基因组文库的部分序列分析揭示一个阳性克隆子ccs24-7(JF737991)上含有编码亚铁螯合酶的开放阅读框,将此基因命名为ccs24-7-f。本研究发现：这个基因完整,可以编码一个含361个氨基酸长度的蛋白质。DNAMAN软件预测这个蛋白大小为40.98kD,蛋白质的等电点pI为8.95,系统进化树分析揭示该基因是来自于p变形菌纲的某个菌。(2)亚铁螯合酶基因的克隆和原核表达以克隆子ccs24-7(JF737991)为模板,设计基因特异性引物,扩增此功能基因。克隆到常用的表达载体pET-28a上,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3),建立了这个基因的原核表达系统。对诱导条件进行优化,确定蛋白可溶性表达的最佳条件为温度8℃,IPTG浓度为0.25mmol/L,诱导表达24小时。接着用镍柱对蛋白纯化,最佳咪唑洗脱浓度为200mmol/L。(3)亚铁螯合酶酶活性测定首先以原卟啉和锌离子作为底物建立酶活分析系统,测得亚铁螯合酶反应的最适pH为7.6,反应的pH条件偏碱性。其最适温度是28℃,这是目前关于亚铁螯合酶的研究中酶温度最低的报道,推测可能是由于该亚铁螯合酶基因来自于北极深海的特殊环境,从而可以认为该酶是一种耐冷型酶。本文第二部分是对一株抗肿瘤抗生素(kalafungin)的产生菌进行了基因组文库构建。kalafungin能以一种新颖机制阻断多种肿瘤细胞的信号传导,但目前关于这个抗生素的生物合成研究较少。本研究通过基因组总DNA的提取、物理切割DNA、末端修复、修复后DNA的大小选择、DNA的回收、与载体的连接反应、噬菌体包装、感染大肠杆菌等步骤,建立了该菌株的基因组文库。然后随机挑取克隆提取质粒酶切以及电泳分析表明此基因组文库具有较好的多样性,平均插入片段大小为40.5kb(符合预期),这为后面继续从分子水平上对kalafungin功能基因的研究提供了有利的平台。

关键词：北极深海沉积物亚铁螯合酶诱导表达酶活测定 kalafungin 基因组文库

亚铁螯合酶对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的影响及作用机制研究

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浙江医学 2021年第9期43卷 942-945页

作者：孙维栋余醒醒安依涵王鑫王莹童向民浙江省人民医院肿瘤分子诊断与个体化研究重点实验室杭州310014 绍兴市中心医院血液内科

目的探讨亚铁螯合酶(FECH)对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的影响及作用机制。方法设计并合成靶向FECH的短发夹RNA(shRNA),转染至RPMI8226细胞,并用Western blot法验证。采用CCK-8法测定FECH shRNA RPMI8226细胞和空载对照RPMI8226细胞的... 详细信息

目的探讨亚铁螯合酶(FECH)对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的影响及作用机制。方法设计并合成靶向FECH的短发夹RNA(shRNA),转染至RPMI8226细胞,并用Western blot法验证。采用CCK-8法测定FECH shRNA RPMI8226细胞和空载对照RPMI8226细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)产生情况,Western blot法检测细胞铁调节蛋白2(IRP2)、转铁蛋白受体1(TfR1)、过氧化氢酶(Catalase)的表达情况。结果与空载对照RPMI8226细胞相比,FECH shRNA RPMI8226细胞增殖能力减弱(P<0.05),ROS产生增多(P<0.05),IRP2、TfR1表达上调(均P<0.05),Catalase表达下调(P<0.05)。结论FECH对维持RPMI8226细胞氧化还原的动态平衡起重要作用。FECH表达受抑制后,RPMI8226细胞IRP2、TfR1表达上调,细胞内铁过载,ROS产生增多,同时抗氧化蛋白Catalases表达下调,细胞抗氧化能力下降,引发细胞氧化应激,抑制细胞增殖。

关键词：亚铁螯合酶铁调节蛋白2 转铁蛋白受体过氧化氢酶活性氧多发性骨髓瘤

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线粒体亚铁螯合酶

生物化学与生物物理进展 1987年第5期14卷 23-24页

作者：方林求安徽大学生物系

本文介绍了存在于动物肝脏的亚铁螯合酶的有关性质和生化功能。该酶是血虹素生物合成的最终酶,对血红素合成起着重要的调节作用,其活性降低或缺陷可导致一些疾病发生。

关键词：亚铁螯合酶血红素动物鼠肝生物合成亚铁原卟啉合成酶生化反应卟啉症线粒体内膜卟啉类