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亚油酸异构酶研究进展

中国油脂 2004年第10期29卷 38-42页

作者：张浩曹健常共宇王月囡王育军郑州工程学院生物工程系郑州市嵩山南路140号450052

亚油酸异构酶可催化亚油酸异构化为共轭亚油酸。随着共轭亚油酸的应用日益广泛 ,人们对亚油酸异构酶的研究也日益深入。在查阅大量文献的基础上。

关键词：亚油酸异构酶催化异构化共轭亚油酸研究情况国内外

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亚油酸异构酶分子生物学研究进展

河南工业大学学报（自然科学版） 2010年第1期31卷 88-94页

作者：李凤娟罗宇曹健熊玉春河南工业大学生物工程学院河南郑州450001 中原工学院河南郑州450007 河南工业大学化学化工学院河南郑州450001

对亚油酸异构酶基因克隆、序列分析及基因的外源表达等研究现状进行了综述,并对已经克隆到的酶蛋白序列进行了初步的分析与比对,探讨了其序列与功能之间的相互关系,对亚油酸异构酶的进一步研究进行了展望.

关键词：亚油酸异构酶克隆外源表达序列分析

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亚油酸异构酶及其性质

工业微生物 2002年第4期32卷 51-54,58页

作者：熊向峰陈朝银赵声兰昆明理工大学生化学院昆明650224 云南中医学院昆明650200

共轭亚油酸 (conjugatedlinoleicacids简称CLA)是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸。亚油酸异构酶可将亚油酸转化成CLA ,亚油酸异构酶可以特异性地转化合成CLA ,克服了化学法催化合成CLA的缺点。本文介绍了亚油酸异构酶的来源、分离纯... 详细信息

共轭亚油酸 (conjugatedlinoleicacids简称CLA)是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸。亚油酸异构酶可将亚油酸转化成CLA ,亚油酸异构酶可以特异性地转化合成CLA ,克服了化学法催化合成CLA的缺点。本文介绍了亚油酸异构酶的来源、分离纯化 ;比较了Butyrivibriofibrisolvens、Lactobacillusreuteri、Propionibacteriumacnes、Clostridiumsporogenes等来源的亚油酸异构酶的性质。

关键词：亚油酸异构酶性质来源分离纯化

双歧杆菌源亚油酸异构酶的原核表达及功能分析

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食品与发酵工业 2023年第23期49卷 64-69页

作者：嵇熠彬梅永超杨波陈海琴江南大学食品学院江苏无锡214122

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase,BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体,构建组氨酸标签分别位于C端和N端的... 详细信息

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase,BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体,构建组氨酸标签分别位于C端和N端的重组载体pET-28a(+)-bbi-His和pET-28a(+)-His-bbi,分别实现其在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)3种类型的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中的异源表达和条件优化。结果表明表达BBI的最优重组菌为*** Rosetta/pET-28a(+)-bbi-His,最佳诱导条件为以1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导8 h,且当用BBI粗酶转化脂肪酸时,相较于亚油酸和γ-亚麻酸,BBI更偏好转化α-亚麻酸。

关键词：大肠杆菌亚油酸异构酶共轭脂肪酸条件优化底物偏好性

亚油酸异构酶PAI的表达优化及其固定化研究

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亚油酸异构酶PAI的表达优化及其固定化研究

作者：黎标杭州师范大学

学位级别：硕士

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸化合物的统称,具有抗癌,抗衰老,抗动脉粥样硬化,调节机体脂质代谢,增强机体综合免疫力等重要作用,在食品和医疗领域具有广阔的应用前景。本文主要通过来源于痤疮... 详细信息

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸化合物的统称,具有抗癌,抗衰老,抗动脉粥样硬化,调节机体脂质代谢,增强机体综合免疫力等重要作用,在食品和医疗领域具有广阔的应用前景。本文主要通过来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶(Propionibacterium acnes Linoleate Isomerase,PAI)基因的原核表达系统构建;重组菌发酵条件优化以及对PAI的固定化,研究PAI生物催化亚油酸合成trans-10,cis-12CLA的功能,为开发研究生物催化合成CLA提供参考。(1)PAI基因的原核表达系统构建:依据NCBI公布的痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因(序列号AX062088)经密码子优化后合成PAI基因,构建重组质粒pET24a-pai。将重组质粒转化到感受态细胞*** BL21(DE3)中,构建了BL21(DE3)-pET24a-pai重组菌株,通过微生物发酵实现目的基因的异源表达,成功构建了PAI基因的原核表达系统。⑵重组菌发酵条件优化:通过自诱导发酵培养基(ZYM-5052)发酵提高了PAI表达量及酶催化活性,自诱导发酵PAI催化合成trans-10,cis-12CLA的转化率是IPTG诱导发酵的2.15倍。响应面优化设计实验结果显示温度、甘油、阿拉伯糖是影响PAI表达的主因素,按照优化后最佳条件进行自诱导发酵,PAI的催化合成CLA的转化率由28%提高到35.5%。⑶PAI的固定化:利用固定化酶技术、树脂为载体进行PAI的固定化,初步实现了PAI的固定化,但PAI固定化酶催化合成CLA的转化率最高为28%,是粗酶液催化活性的79.3%,且PAI固定化酶重复催化合成CLA的活性下降较快,重复催化次数少,第4次的催化转化率不到10%。因此,仍需对固定化材料、固定化方法作进一步探究。

关键词：共轭亚油酸亚油酸异构酶自诱导响应面设计固定化酶

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亚油酸异构酶定向进化研究

亚油酸异构酶定向进化研究

作者：时旭沈阳农业大学

学位级别：硕士

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid,CLA）是一类具有不同位置和几何异构体的十八碳二烯酸的总称。CLA因结构多样而具有不同的生理功能,目前研究较多的活性异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。生物合成法利用亚油酸异构酶催化LA生成... 详细信息

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid,CLA）是一类具有不同位置和几何异构体的十八碳二烯酸的总称。CLA因结构多样而具有不同的生理功能,目前研究较多的活性异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。生物合成法利用亚油酸异构酶催化LA生成不同类型的CLA,因其产物结构单一、安全性更高而受到研究人员的青睐,但是亚油酸异构酶催化能力仍有待提高。本研究以发酵乳中分离的植物乳杆菌和市售痤疮丙酸杆菌基因组为模板,克隆表达植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原基因（Myosin-Cross-Reactive Antigen,mcra）和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因（linoleic acid isomerase gene,lai）,利用易错PCR突变两种基因,获得吸光度值和CLA产量可能提高的菌株,通过流式细胞术筛选携带绿色荧光蛋白标签的重组菌,快速得到正突变子,对部分提高显著的突变株测序,分析突变前后的亚油酸异构酶基因,探究差异位点对产量的影响。从五份内蒙古传统发酵乳中筛选鉴定到10菌株,选择CLA产量较高的植物乳杆菌HAC01,测定其发酵性能,利用均匀设计优化发酵条件为接种量4%,LA添加量为0.7mg/mL,在pH 6.5、37℃条件下发酵32 h,4℃后熟12 h。克隆植物乳杆菌的mcra和痤疮丙酸杆菌的lai:lai-pl（ORF1695bp）和lai-p（ORF1275bp）,经测序比对,与相应菌株的基因相似性为100%,且无氨基酸序列突变,说明克隆成功。将两种基因分别与pCold-SUMO可溶性原核表达载体连接,转化表达于大肠杆菌,lai-pl基因表达分子蛋白大小约70 kDa,lai-p基因表达分子蛋白大小约55 kDa。利用易错PCR技术突变lai-pl和lai-p,连接绿色荧光蛋白基因gfp,构建标签表达载体pCold-gfp-yclai-pl和pCold-gfp-yclai-p,结合流式细胞术筛选正突变菌株,在282株pCold-gfp-yclai-pl重组菌中,吸光度值提高的菌株有243株,提高率86.2%,其中提高最多的为155号菌,突变前吸光度值为0.1746±0.0002,突变后达到1.0506±0.0004,产量提高了6.02倍;174株pCold-gfp-yclai-p重组菌中,CLA产量提高的菌株有156株,提高率89.6%,其中产量最高的为39号菌,突变前CLA产量为2.9137±0.0000μg/mL,突变后达到11.6186±0.0036μg/mL,产量提高了3.99倍。对pCold-gfp-yclai-pl重组菌测序后得到完整序列的菌株为53号,该菌株的氨基酸突变位点为Y-C（69位）、L-P（77位）、F-L（174位）和N-S（486位）,生物学信息分析推测亚油酸异构酶系MCRA蛋白催化产物量提高与38-69氨基酸位的构型变化有关,69位的氨基酸突变为亚油酸异构酶系mcra的有益突变位点。本文对吸光度值提高的菌株进行了MCRA相关蛋白的一级、二级和三级结构的生物信息学分析,为进一步阐释亚油酸异构酶的作用机理和定点突变提高CLA产量提供理论依据。

关键词：亚油酸异构酶定向进化流式细胞术发酵特性

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亚油酸异构酶高产菌株选育及其酶学特性研究

亚油酸异构酶高产菌株选育及其酶学特性研究

作者：章立新合肥工业大学

学位级别：硕士

共轭亚油酸（Conjugated LinoleicAcid，CLA）具有增强免疫调节、抗动脉粥样硬化、抑制癌症、减肥、抗氧化等生理功能。目前，CLA主要由化学合成法和生物合成法得到，而生物合成法因其反应条件温和，产物成分较单一，在食品医药领域展... 详细信息

共轭亚油酸（Conjugated LinoleicAcid，CLA）具有增强免疫调节、抗动脉粥样硬化、抑制癌症、减肥、抗氧化等生理功能。目前，CLA主要由化学合成法和生物合成法得到，而生物合成法因其反应条件温和，产物成分较单一，在食品医药领域展现出了良好的应用潜力。本文以黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等为原材料，结合气质联用仪检测方法，从中筛选出具有转化亚油酸为共轭亚油酸能力相对较高的菌株，并对其进行菌种鉴定。以CLA转化率为考察指标，优化了菌株产共轭亚油酸的发酵条件，并对亚油酸异构酶的分离纯化及其酶学特性进行了研究。主要结论如下：（1）从泡菜环境中筛选出具有较高CLA转化能力的的菌株——PC-3菌株，其能转化LA为具有生物活性的c9, t11-CLA和t10, c12-CLA。结合气质联用仪检测方法，经形态学、生理生化试验及16S rDNA序列分析，鉴定PC-3菌株为植物乳杆菌亚种PC-3菌株，其16S rDNA基因序列长度为1460bp，序列提交到GenBank登记，登陆号为JX270774.1。（2）采用单因素试验和响应面试验设计方法，结果表明植物乳杆菌亚种PC-3菌株发酵的主要影响因素是培养时间、接种量和LA添加量，其较佳的发酵条件：诱导培养基为MRS培养基、培养时间为43.0h、接种量为3.0%（v/v）、LA添加量为1.30‰（v/v）、乳糖:硫酸铵=3:2、乳化剂Tween-80添加量为2.0‰（w/v）。（3）采用超声波与酶法相结合的细胞破碎方法。超声波破碎次数为80次（超声3s，间歇4s，功率400w），溶菌酶添加浓度为0.8%，菌悬液浓度为15%g/mL，碎菌液体积为4mL，NaCl浓度为0.1mol/L。硫酸铵分段沉淀的饱和度范围为20%80%，超滤后进行葡聚糖凝胶G-100过滤层析，提高植物乳杆菌亚种PC-3菌株亚油酸异构酶的纯化倍数可达4.60。经不连续SDS-PAGE电泳，测得该酶的相对分子量为42.88kDa。该酶最适反应温度为35℃，最适反应pH值为4.0，其热稳定性较差，在低温弱酸性条件下易于保存。该酶的Km=13.95mmol/L，Vmax=9.03mmol/L·h。

关键词：共轭亚油酸菌株选育植物乳杆菌亚种PC-3菌株响应面分析法亚油酸异构酶

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亚油酸异构酶基因的克隆及表达

亚油酸异构酶基因的克隆及表达

作者：郎建华内蒙古农业大学

学位级别：硕士

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是必需脂肪酸亚油酸的衍生物,具有抗肿瘤、降低胆固醇、抗氧化、增强免疫等功能,而亚油酸本身并不具备这些功能。已有实验证明,亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)可将亚油酸转化为共... 详细信息

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是必需脂肪酸亚油酸的衍生物,具有抗肿瘤、降低胆固醇、抗氧化、增强免疫等功能,而亚油酸本身并不具备这些功能。已有实验证明,亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)可将亚油酸转化为共轭亚油酸。亚油酸异构酶及其基因的获得对于工业化生产CLA具有重要的意义。本实验以发酵菌剂为原料,从中分离出一株菌落形态上与嗜酸乳杆菌相似的菌株,经16Sr DNA鉴定后确定为嗜酸乳杆菌NCFM,根据Genbank中公布的亚油酸异构酶基因序列设计特异性引物进行PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定克隆成功后,亚克隆到表达质粒pMG36e中,构建表达载体pMG36e-LAI,转化到大肠杆菌DH5α中,经菌落PCR和酶切分析初步证明转化成功后进行表达分析。将pMG36e-LAI-DH5α菌株进行细胞破碎,提取粗酶液经过硫酸铵分级沉淀、层析分离纯化亚油酸异构酶后,通过酶活力测定和SDS-PAGE检测亚油酸异构酶的分子量,证明LAI获得了表达,这将为LAI基因转入乳酸菌和其它基因工程菌奠定基础,不仅会进一步生产CLA提供技术支撑,也会有助于工业化生产高产量、高活性亚油酸异构酶制剂。

关键词：亚油酸异构酶基因克隆嗜酸乳杆菌

瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

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食品科学 2017年第6期38卷 1-5页

作者：刘晓华李慧美柯颖笑张凯强李响敏李欣付金衡李海星南昌大学中德联合研究院食品科学与技术国家重点实验室江西南昌330047

以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。

关键词：共轭亚油酸亚油酸异构酶干酪乳杆菌克隆表达