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五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型的建立和TLR2介导炎症相关因子的表达

中国农业科学 2012年第2期45卷 346-352页

作者：王攀陶晓莉沈祖楠李和刚潘杰牟玉莲李奎山东师范大学生命科学学院中国农业科学院北京畜牧兽医研究所华中农业大学动物医学院

【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶... 详细信息

【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1μ***-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1μ***-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10μ***-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的表达量。【结果】分离得到的主动脉内皮细胞呈铺路石样整齐排列,且生长状态良好;细胞膜上表达CD31分子和Ac-LDL的受体,证实分离得到的细胞是血管内皮细胞。LPS刺激后细胞TLR2 mRNA水平的表达量明显升高(P五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型,并检测到TLR2在LPS刺激内皮细胞后表达量升高,能够介导细胞炎症相关因子的表达。

关键词：五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞 TLR2

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五指山小型猪近交系白细胞抗原Ⅰ类3基因的研究

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中国农业科学 2007年第9期40卷 2053-2061页

作者：孙俊丽牟玉莲刘小林冯书堂王素荣中国农业科学院畜牧研究所西北农林科技大学承德职业学院

【目的】为探讨五指山小型猪(WZSP)近交系群体中SLAⅠ3(SLA-3)位点等位基因分布结构及其特性。【方法】利用4对引物,采用RT-PCR扩增了32头WZSPSLA-3基因部分外显子1、外显子2和大部分外显子3序列。根据家系和扩增结果,选择8头个体的PCR... 详细信息

【目的】为探讨五指山小型猪(WZSP)近交系群体中SLAⅠ3(SLA-3)位点等位基因分布结构及其特性。【方法】利用4对引物,采用RT-PCR扩增了32头WZSPSLA-3基因部分外显子1、外显子2和大部分外显子3序列。根据家系和扩增结果,选择8头个体的PCR产物克隆测序。【结果】获得9个不同的核苷酸序列。与GenBank中所用SLA-3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较分析,确定这9个序列均为SLA-3位点上的新等位基因,但这些等位基因间核苷酸变异很少;氨基酸序列比较发现猪和人之间有很高的保守性。同时,构建了23个SLA-3的等位基因和1个HLA-A等位基因核苷酸序列的系统树。【结论】WZSP在SLA-3位点和其它猪品种有明显的差异,拥有其独特的遗传资源。从分子水平为WZSPSLA-3基因的分子分型及特异单倍体猪的培育和异种器官移植实验用动物的研究提供理论依据。

关键词：五指山小型猪近交系白细胞抗原经典SLAⅠ3基因 RT-PCR

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五指山小型猪近交系心、肝和肾的微观形态学研究

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安徽科技学院学报 2013年第5期27卷 5-11页

作者：王趁芳杨树林靳二辉李升和安徽科技学院动物科学学院安徽凤阳233100 中国农业科学院畜牧兽医研究所北京100193

为了研究五指山小型猪近交系心、肝和肾的微观形态学特点。本试验选用2、4和12月龄五指山小型猪近交系18只(n=6),分别采用光镜和透射电镜技术对心、肝和肾的显微和超微结构进行观察。结果显示,随着月龄增加,五指山小型猪近交系心室壁的... 详细信息

为了研究五指山小型猪近交系心、肝和肾的微观形态学特点。本试验选用2、4和12月龄五指山小型猪近交系18只(n=6),分别采用光镜和透射电镜技术对心、肝和肾的显微和超微结构进行观察。结果显示,随着月龄增加,五指山小型猪近交系心室壁的心内膜层逐渐增厚,心肌细胞排列逐渐密集,心肌细胞间出现大小不等的脂肪泡,心室肌细胞间闰盘结构不明显;12月龄心内膜内皮下层出现平滑肌样细胞团;肝小叶逐渐增大,小叶间结缔组织变薄,肝细胞排列密集,肝血窦内枯否氏细胞增多。肾小体数量增多,血管球体积增大,肾小囊变小,肾小管上皮细胞增厚。电镜下,12月龄五指山小型猪近交系心肌细胞胞质内肌原纤维明带和暗带清晰可见,其间夹有丰富的线粒体;肝细胞胞质内富含线粒体和游离的糖原颗粒,部分胞质内含有大小不一的脂滴,肝血窦面微绒毛不发达,狄氏隙内贮脂细胞较大,周围有丰富的网状纤维;肾小球毛细血管内皮细胞较厚,近端小管上皮细胞腔面有丰富的微绒毛,远端小管上皮细胞基底面质膜内褶不发达。以上观察结果表明,五指山小型猪心,肝和肾的微观形态结构与人和其它哺乳动物基本相似,但有其自身的特点。

关键词：五指山小型猪近交系心肝肾微观形态学

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PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析

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中国农业科学 2017年第19期50卷 3808-3816页

作者：张雪黄雷阮进学刘志国程英冯书堂牟玉莲李奎中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9,PCSK9)基因是人类高胆固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia,ADH)的主效基因之一,其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的降解能力比野生型蛋白强十倍,增加了患高胆固醇血症的风险,从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近,成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏,且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪,以模拟动脉血管的病理学变化,加速发病进程,为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9基因D374Y突变体载体,用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中,并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法,分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时,通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现,至第7天形成较大的单克隆点,且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段,说明外源片段在基因组中具有完整性;将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞,通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot检测结果显示,D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中,且有串联重复现象;RT-PCR和QPCR检测结果表明,人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录,且在其它内脏器官,如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达,而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低;Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中,且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现,与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外,对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化,该结果说明,LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突变体的克隆猪;与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR水平显著降低,并且克隆猪肝脏发生了明显病变。

关键词： D374Y突变体体细胞核移植五指山小型猪近交系 LDLR

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