检索结果-南通市图书馆

中国兽医科学 2024年

作者：尹号尤留超黄蓉韩瑞高鹏程支飞杰马轲付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

通过在牛支原体中表达GP35蛋白，利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子，将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明，牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白，前者为参与DNA复制过程的重要蛋白，而后者与DNA... 详细信息

通过在牛支原体中表达GP35蛋白，利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子，将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明，牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白，前者为参与DNA复制过程的重要蛋白，而后者与DNA重组过程相关。完成对GP35、SSB和RmuC蛋白的原核表达后，通过pull-down确定了GP35蛋白与SSB蛋白和RmuC蛋白存在互作关系，结果将有助于解析GP35蛋白在牛支原体中介导重组的机制。

关键词：牛支原体 GP35重组酶互作分子同源重组

来源：

同方期刊数据库评论

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

HeLa细胞中与沙眼衣原体CT224互作分子的初步鉴定

HeLa细胞中与沙眼衣原体CT224互作分子的初步鉴定

引用

作者：陈立芳河北北方学院

学位级别：硕士

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种严格在活细胞内寄生、具有独特发育周期的病原微生物,在感染宿主细胞后所形成的包涵体内进行复制。包涵体膜蛋白(Inclusion membrane proteins,Incs)是一类主要由衣原体基因编码的特异性蛋白... 详细信息

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种严格在活细胞内寄生、具有独特发育周期的病原微生物,在感染宿主细胞后所形成的包涵体内进行复制。包涵体膜蛋白(Inclusion membrane proteins,Incs)是一类主要由衣原体基因编码的特异性蛋白,作为包涵体的重要组成部分,它们可以通过调控宿主细胞的多种生物学过程进而维系衣原体的生长发育。CT224是已经实验证实的Incs,且通过亲和纯化质谱技术结合生物信息学分析预测出了3个与其相互作用可能性较高的分子:卵黄羧肽酶样蛋白(vitellogenic carboxypeptidase-like protein,CPVL)、肿瘤坏死因子受体相关因子7(TNF receptor-associated factor 7,TRAF7)、外周型苯二氮受体相关蛋白1(peripheral-type benzodiazepine receptorassociated protein 1,BZRAP1)。但是,这些分子是否真的与CT224相互作用仍需经过实验证实。因此,本研究拟在制备抗CT224多克隆抗体的基础上利用GST pull-down技术及免疫共沉淀技术对He La细胞中可能与CT224相互作用的上述分子做进一步确认,以期为深入探讨CT224的生物学功能奠定基础。首先,制备CT224的多克隆抗体。利用基因克隆技术构建原核表达载体p GEX-6P-2-Ct224,并诱导表达为GST-CT224融合蛋白,经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,末次免疫一周后采血,分离血清。将构建的pc DNA3.1/myc-His(-)A-Ct224转染He La细胞并培养至36h,经固定、透膜、封闭后,分别用1:300的鼠抗GST-CT224血清(实验组)和1:800的鼠抗Myc抗体(对照1组)孵育,二抗均为Cy3标记的羊抗鼠Ig G抗体,经DAPI染核后在激光共聚焦显微镜下观察。同时设立未转染的He La细胞为对照2组,一抗、二抗同实验组。结果显示,实验组和对照1组中有红色荧光信号出现,对照2组无荧光信号。将pc DNA3.1/myc-His(-)A-Ct224转染48h后的He La细胞裂解、离心、收集上清,分为两组。实验组一抗为1:2 000的鼠抗GST-CT224血清,对照组一抗为1:3 000的鼠抗Myc抗体,两组二抗均为HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体。Western Blot结果显示,两组均只出现一条带,且位置相同。以上实验结果表明成功制备了CT224的多克隆抗体。其次,采用GST pull-down技术验证CT224的互作分子。将GST-CT224融合蛋白(实验组)和GST蛋白(对照1组)经GST beads纯化后分别作为诱饵蛋白,与He La细胞裂解液上清共孵育,离心洗涤后的沉淀物进行Western Blot分析。同时将He La细胞裂解液上清和未孵育的GST-CT224作为对照(分别为对照2组和对照3组)。经电泳、转膜、封闭后,各组依次用CT224、CPVL、TRAF7和BZRAP1四种蛋白的抗体作为一抗进行孵育,然后加入对应的HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体或HRP标记的羊抗兔Ig G抗体,ECL显影。结果显示,实验组出现CT224、TRAF7和BZRAP1对应的条带,对照1组无条带出现,对照2组出现CPVL、TRAF7和BZRAP1对应的条带,对照3组只出现CT224对应的条带。以上结果表明CT224在体外可与TRAF7和BZRAP1相互作用,而不与CPVL相互作用。最后,利用免疫共沉淀技术验证CT224的互作分子。收集pc DNA3.1/myc-His(-)A-Ct224转染后的He La细胞裂解液上清,加入Myc beads,吸附、离心,所得沉淀物设为实验组。pc DNA3.1/myc-His(-)A转染的He La细胞(处理同实验组)设立为对照1组,未转染的He La细胞裂解液上清设立为对照2组。经电泳、转膜、封闭后,各组依次用CT224、CPVL、TRAF7和BZRAP1四种蛋白的抗体作为一抗进行孵育,然后加入对应的二抗(HRP标记的羊抗鼠Ig G抗体或HRP标记的羊抗兔Ig G抗体),ECL显影。结果显示,实验组出现CT224、TRAF7和BZRAP1对应的条带,对照1组无条带出现,对照2组出现CPVL、TRAF7和BZRAP1对应的条带。以上结果表明CT224在He La细胞内可与TRAF7和BZRAP1相互作用,而不与CPVL相互作用。综合上述实验结果,本研究进一步证明了CT224与TRAF7和BZRAP1存在相互作用,而与CPVL无相互作用。提示CT224可能参与干扰宿主细胞促凋亡途径及抑制宿主免疫应答等功能,这将为进一步探究CT224的生物

关键词： CT224 TRAF7 BZRAP1 免疫共沉淀技术 GST pull-down技术互作分子

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

HeLa细胞中Cpn0146相关互作分子的筛选及初步鉴定

HeLa细胞中Cpn0146相关互作分子的筛选及初步鉴定

引用

作者：刘燕河北北方学院

学位级别：硕士

肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,Cpn)是一类胞内寄生的病原微生物,具有独特的二相发育周期,易引起肺部感染,与人类心脑血管疾病的发展息息相关。已有研究发现,部分衣原体基因编码的分泌性蛋白及包涵体膜蛋白(inclusion membrane protei... 详细信息

肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,Cpn)是一类胞内寄生的病原微生物,具有独特的二相发育周期,易引起肺部感染,与人类心脑血管疾病的发展息息相关。已有研究发现,部分衣原体基因编码的分泌性蛋白及包涵体膜蛋白(inclusion membrane proteins,Incs)在衣原体的生命活动模式中扮演重要的调控角色,其中Cpn0146为已发现的衣原体包涵体膜蛋白,但其存在对衣原体生长发育的潜在影响及其与宿主细胞间相互作用的具体机制至今尚不清楚。因此本研究同时利用液相色谱-光谱法(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)和酵母双杂交技术初步筛选与Cpn0146相互作用的配体分子,然后应用GST Pull-down技术对上述两种技术初筛出的相同配体分子做进一步验证,为进一步揭示Cpn0146的生物学功能提供实验依据。***-MS技术初步筛选Cpn0146的互作分子根据STD基因库提供信息、利用Primer 5.0软件设计含Bam H I和Not I酶切序列的引物,采用PCR技术扩增目的基因Cpn0146,切胶回收纯化PCR产物,用Bam H I和Not I两种限制性内切酶分别切割纯化后的Cpn0146 PCR产物和原核表达载体p GEX-6p2,经T4连接酶连接后,将连接产物转化大肠埃希菌XL1-Blue,通过菌落PCR进行初步筛选,将阳性克隆的菌液测序验证后经IPTG诱导表达融合蛋白GST-Cpn0146。纯化后的融合蛋白GST-Cpn0146与HeLa细胞裂解液上清一同加入离心柱中,室温条件下旋转孵育,用平衡/洗涤缓冲液洗涤后,将富集的蛋白进行胰蛋白酶酶解处理,用提取液提取酶解产物,所得上清经真空离心干燥、脱盐,按照设定条件进行LC-MS,利用Maxquant与Xcalibur软件分析LC-MS鉴定结果。结果显示,与Cpn0146可能发生相互作用的分子有573个,综合分值与峰度值分析,最有可能的互作分子有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)、热休克蛋白90(HSP90)、ADP核糖聚合酶1(PARP1)、脂肪酸合酶(FASN)、肌动蛋白10(Myosin-10)、WD重复蛋白44(WDR44)、通用转录因子Ⅱ-Ⅰ(GTF2I)、真核翻译起始因子5B(EIF5B)、谷胱甘肽S-转移酶P(GSTP1)、丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白2(SRRM2)等。2.酵母双杂交技术初步筛选Cpn0146的互作分子采用Trizol法从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMART技术合成c DNA第一条链后经LD-PCR法获取ds-c DNA,过CHROMA SPIN+TE-400柱子纯化。将纯化好的ds-c DNA与p GADT7-Rec、Herring Tests Carrier DNA转入酵母菌株Y187进行同源重组,在SD/-Leu/Amp平板上培养后,采用菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示文库具有良好的多态性。参照前述方法设计含有Eco R I和Bam H I酶切序列的引物,经PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选得到p GBKT7-Cpn0146重组质粒,进一步测序证实构建成功。将重组质粒p GBKT7-Cpn0146同时转化AH109和Y187的酵母菌株中,检测证实其无自激活活性和细胞毒性。将含有p GBKT7-Cpn0146的AH109与含有HeLa细胞c DNA文库的Y187进行杂交,待酵母接合子(三叶草)形成后涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸营养缺陷型培养基和涂有X-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上初筛,收集阳性菌落,进一步利用β-半乳糖苷酶印膜法筛选。提取阳性菌液(对应显蓝色菌落)中的酵母质粒,转化感受态细胞XL1-Blue,进行菌落PCR再次验证。验证阳性后进行回交实验,得到回交阳性菌落,经测序后与基因库中人类的m RNA进行BLAST比对确定配体分子。结果显示,与Cpn0146可能发生互作的分子有:热休克蛋白90(HSP90)、ADP核糖聚合酶1(PARP1)、肌动蛋白(Myosin-10)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、人类延伸因子1-α1(EEF1A1L14)、ATP合成酶、60s核糖体蛋白、23s核糖体RNA、核糖体蛋白RPL36a、Eukaryotic synthetic construct chromosome 14和p DEST-GADT7。***-down技术初步鉴定Cpn0146的互作分子应用Pull-down技术验证上述两种初筛方法中与Cpn0146共同互作的分子。首先将融合蛋白GST-Cpn0146作为诱饵蛋白固定到离心柱中,洗涤后加入HeLa细胞裂解液上清,4℃旋转孵育,再次洗涤后加入

关键词：肺炎衣原体包涵体膜蛋白 Cpn0146 互作分子 HeLa细胞液相色谱-光谱法酵母双杂交技术 Pull-down技术

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：