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作者：韩国英天津中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究首先应用均相时间分辨荧光法（Homogeneous Time-Resolved Flurescence,HTRF）探讨二至方在体外对11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1,11β-HSD1）活性的影响,其次建立糖皮质激素诱导的原代皮层... 详细信息

目的:本研究首先应用均相时间分辨荧光法（Homogeneous Time-Resolved Flurescence,HTRF）探讨二至方在体外对11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1,11β-HSD1）活性的影响,其次建立糖皮质激素诱导的原代皮层神经元细胞损伤模型模拟体外应激状态,从细胞凋亡和突触损伤两方面探讨二至方是否通过11β-HSD1-GC/GR通路发挥神经保护作用,为二至方的临床应用提供实验室依据。方法:选取肝脏微粒体为研究对象,以皮质酮（Corticosterone,CORT）为底物,甘草次酸（Glycyrrhetinic acid,GA）为阳性对照,建立药物筛选模型,采用HTRF法探讨二至方对11β-HSD1活性的影响。体外培养原代皮层神经元细胞,建立地塞米松（Dexamethasone,DEX）损伤模型模拟体外应激状态;采用甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测神经元细胞的细胞活力,乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）法检测LDH的释放量,筛选二至方对原代神经元细胞的安全作用浓度;通过TDT介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记（TDT mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）法检测神经元细胞的凋亡率,蛋白免疫印迹（Western blot）法检测活化型半胱天冬酶-3（Cleaved caspase-3）/半胱天冬酶-3（caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）/Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）的表达;通过免疫荧光染色法检测微管相关蛋白2（Microtuble associated protein 2,MAP-2）的荧光表达,Western blot法检测突触相关蛋白突触素（synaptophysin,SYN）和突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95,PSD95）的表达;应用免疫荧光染色、Western blot和磷酸钙沉淀法检测11β-HSD1-GC/GR信号通路相关蛋白的表达,探讨二至方的神经保护作用机制。结果:1.二至方0.1-100μg/m L对肝脏微粒体11β-HSD1活性具有显著的抑制作用（P二至方0.01-10μg/m L对神经元细胞的细胞活力和LDH释放量无明显影响（P>0.05）;二至方100μg/m L可显著降低神经元细胞的细胞活力（P二至方0.01-10μg/m L用于研究。3.与Control组相比,10、10 mol/L的DEX作用神经元72 h时,细胞活力和LDH释放无明显变化（P>0.05）;10、10 mol/L的DEX处理神经元时细胞活力显著降低（P二至方0.1-10μg/m L显著提高细胞活力（P0.05）;后续实验选取二至方0.1-10μg/m L用于研究。5.与DEX组相比,二至方0.1-10μg/m L显著降低神经元细胞凋亡（P二至方1-10μg/m L显著增加MAP-2的荧光蛋白表达（P0.05）。7.免疫荧光染色结果显示GR主要表达于原代皮层神经元细胞的胞质。与DEX组相比,GR受体阻断剂RU486显著上调GR蛋白表达（P二至方10μg/m L明显上调GR蛋白表达（P二至方0.1-10μg/m L可下调11β-HSD1蛋白表达（P>0.05）,11β-HSD1抑制剂CBX可明显下调11β-HSD1蛋白表达（P<0.05）;与CBX组相比,CBX+

关键词：二至方神经元细胞应激糖皮质激素药效研究机制研究凋亡突触可塑性

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二至方加味前后成分表征及药代动力学研究

二至方加味前后成分表征及药代动力学研究

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作者：陈婉宁天津中医药大学

学位级别：硕士

二至方（Erzhi Formula,EZF）作为补肝益肾的良药,一直被广泛使用并推崇。2020版《中国药典》记载,二至丸（二至方制剂）由等量的女贞子（酒制）及墨旱莲加炼蜜混合制得。二至方包含三萜类、香豆素类、环烯醚萜类、酚酸类、苯乙醇类、... 详细信息

二至方（Erzhi Formula,EZF）作为补肝益肾的良药,一直被广泛使用并推崇。2020版《中国药典》记载,二至丸（二至方制剂）由等量的女贞子（酒制）及墨旱莲加炼蜜混合制得。二至方包含三萜类、香豆素类、环烯醚萜类、酚酸类、苯乙醇类、黄酮类等多种化学成分,这些化学成分使得二至方具有广泛的药理活性及临床应用,尤其在滋阴补肾、壮筋骨、乌须发等方面疗效显著。现代医者常常会在二至方的基础上加入不同补益的药材去增强某些特定的疗效而应用于临床,即加味二至方（Jia Wei Erzhi Pill,JWEZF）。中药复方往往化学成分复杂,且含量、极性差异较大,阻碍了其化学成分的分离及表征。本文首先建立了超高效液相色谱/四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC/Q-Orbitrap MS）方法,对色谱柱、柱温、流动相、质谱参数、以及样品复溶溶剂等进行了优化,针对二至方（EZF）、加味二至方（加鸡血藤）(JW-3-EZF)及加味二至方（加鸡血藤和牛膝）(JW-4-EZF)的化学成分进行有效分离、表征,获得分离度高、峰型好、质谱有效数据点多的LC-MS分析条件,便于定性比较。同时根据前期的化学工作基础及参考文献,建立EZF、JW-3-EZF和JW-4-EZF已报到的化学成分数据库,经过动态质量亏损范围（±10 ppm）移除非目标化合物后,建立基于质量亏损过滤（MDF）技术的母离子列表（PIL）,并在Q-Orbitrap高分辨质谱仪上建立快速正/负离子切换的改进型数据依赖采集技术（PIL/Full MS/dd-MS/DDA）,同时开启“If idle-pick others”功能,采用靶向与非靶向相结合的方式进行数据采集。最后使用Compound Discoverer软件进行数据处理,通过与标准品、文献、以及数据库比对等方式探究高分辨质谱数据的裂解规律,实现EZF、JW-3-EZF及JW-4-EZF的多成分表征。在成分表征的基础上,本课题对大鼠分别灌胃EZF,JW-3-EZF和JW-4-EZF后的入血成分进行了鉴定。同时建立了高灵敏度的超高效液相色谱-串联三级杆质谱联用方法（UPLC-QQQ-MS）,通过准确度、精密度、基质效应、提取回收率、以及稳定性等方法学考察,对大鼠口服EZF、JW-3-EZF和JW-4-EZF后血浆样品中芹菜素、木犀草苷、木犀草素、橄榄苦苷、蟛蜞菊内酯、毛蕊花糖苷、特女贞苷、木樨榄苷-11-甲酯、旱莲苷A、芒柄花素和β-蜕皮甾酮等十一种指标成分的药代动力学进行了系统研究。结果表明:从EZF、JW-3-EZF和JW-4-EZF中分别鉴定出124、162和177个化合物,主要为苯乙醇苷类、黄酮类、环烯醚萜类、三萜类、酚酸类、有机酸、甾酮类等,其中110个化合物为共有成分。对于二至方来说,鸡血藤和牛膝的加入,显著增加了黄酮类、环烯醚萜苷类和甾酮类成分的含量。11种入血成分的药动学研究为中药复方的临床研究提供了药代动力学参数指导。其中蟛蜞菊内酯、木樨榄苷-11-甲酯、木犀草素和芹菜素达峰浓度相对较高。EZF、JW-3-EZF和JW-4-EZF三种提取物大鼠灌胃后各目标化合物药时曲线趋势基本一致,但药代动力学参数有显著差异。对于二至方来说,鸡血藤和牛膝的加入使特女贞苷的达峰时间及半衰期均延长;在二至方中仅加入鸡血藤时,芹菜素、木樨榄苷-11-甲酯、木犀草素、木犀草苷、蟛蜞菊内酯和毛蕊花糖苷的药时曲线下面积AUC显著增加;同时加入鸡血藤和牛膝时,芹菜素、蟛蜞菊内酯和毛蕊花糖苷的药时曲线下面积AUC显著增加。总的来说,鸡血藤和牛膝的加入在一定程度上改变了二至方中的一些有效成分的达峰浓度C和药时曲线下面积AUC、AUC等药代动力学参数。JW-3-EZF入血后各药代动力学参数表明各目标化合物体内暴露更高、效果更好。本实验为加味二至方的新药研发及临床的广泛应用提供了一定的科学依据。

关键词：二至方加味二至方药代动力学 LC-MS 质量亏损过滤

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基于胶原蛋白的合成和降解探讨二至方对光老化小鼠皮肤的保护作用及机制研究

基于胶原蛋白的合成和降解探讨二至方对光老化小鼠皮肤的保护作用...

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作者：王子静天津中医药大学

学位级别：硕士

背景:皮肤光老化是指由于长期紫外线(ultraviolet,UV)辐射所造成的皮肤衰老。在光老化的进程中,真皮层的改变最显著,胶原蛋白是真皮层最主要的蛋白质成分,能够增强皮肤的抗拉伸强度,维持皮肤弹性,UV辐射能够加速胶原蛋白的降解,抑制胶... 详细信息

背景:皮肤光老化是指由于长期紫外线(ultraviolet,UV)辐射所造成的皮肤衰老。在光老化的进程中,真皮层的改变最显著,胶原蛋白是真皮层最主要的蛋白质成分,能够增强皮肤的抗拉伸强度,维持皮肤弹性,UV辐射能够加速胶原蛋白的降解,抑制胶原蛋白的生成,使皮肤出现松弛、皱纹等表现,故修复胶原蛋白是防治光老化的重要机制之一。中医理论认为光老化主要病机为正虚邪实,五脏虚损,阴津亏虚,皮毛腠理失养,加上光毒侵袭,耗伤阴液,导致肌肤失于濡养。肾阴为诸阴之根本,是腠理皮毛阴液之本源,肝为肾之子,若肝阴不足,则子病及母,阴液不能下输于肾,滋补肝肾之阴是延缓光老化的重要治法。二至方长于滋补肝肾之阴,临床上常用于治疗衰老相关疾病。本课题组前期研究二至方对UVB损伤人皮肤角质形成细胞具有确切的保护作用,但其是否对UV致光老化小鼠皮肤具有保护作用,影响真皮层,调控胶原蛋白的合成与降解及其相关机制还有待于进一步探究。目的:基于胶原蛋白的合成和降解探究二至方对UV辐射引起的光老化的保护作用及机制,为二至方防治皮肤光老化的应用提供实验室依据。方法:激活蛋白-1(AP-1)通过调控基质金属蛋白酶(MMPs)和转化生长因子-β(TGF-β)在胶原蛋白的降解和合成中发挥重要作用。建立AP-1双荧光素酶报告基因系统,研究二至方对AP-1转录活性的影响。采用UV辐射ICR小鼠建立光老化模型,通过小鼠皮肤HE、Masson及Weigert’s染色来明确二至方对光老化小鼠皮肤外观及病理改变的影响。使用皮肤敏感度测试仪及多探头皮肤测试系统检测小鼠皮肤敏感度、黑色素、皱纹及含水量明确二至方对光老化小鼠皮肤的保护作用。免疫组化检测小鼠皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达情况,羟脯氨酸(Hyp)试剂盒检测Hyp含量,Western blot检测TGF-β/Smad通路相关蛋白表达探究二至方调控胶原蛋白合成延缓光老化的作用。Western blot检测MMP-1、MMP-3、MMP-2、MMP-9及MAPK通路相关蛋白的表达水平,探究二至方调控胶原蛋白降解延缓光老化的作用。结果:1-100μg/m L二至方均能显著抑制293T细胞中AP-1的转录活性。小鼠皮肤HE染色、Masson染色、Weigert’s染色结果显示二至方能显著改善小鼠皮肤的外观及病理状态。二至方能显著降低小鼠皮肤的敏感度,减少黑色素含量,减缓皱纹的生成,提高皮肤含水量。二至方显著提高小鼠皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及Hyp的含量,提高TGF-β/Smad通路中TβRⅠ、TβRⅡ的表达,促进Smad2/3的磷酸化,促进胶原蛋白的生成。同时,二至方显著抑制MAPK通路中P38、JNK、ERK的磷酸化,降低皮肤中MMP-1、MMP-3、MMP-2、MMP-9的蛋白表达,抑制胶原蛋白的降解。结论:二至方能够提高小鼠皮肤组织中真皮层胶原纤维及弹性纤维的含量,提高TGF-β/Smad通路中TβRⅠ、TβRⅡ的表达,促进Smad2/3的磷酸化,促进胶原蛋白的合成,抑制MAPK通路减少胶原蛋白的降解,发挥对UV诱导的皮肤光老化的保护作用。

关键词：二至方光老化胶原蛋白 TGF-β/Smad通路 MAPK通路

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HPLC-MS/MS测定二至方中特女贞苷和蟛蜞菊内酯含量及其在大鼠体内的药动学研究

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中华中医药杂志 2018年第10期33卷 4610-4614页

作者：尹江宁卢国元蒋俊苏州大学附属第一医院苏州215006 江苏大学附属医院镇江212001 江苏大学药学院镇江212013

目的:阐明二至方中特女贞苷和蟛蜞菊内酯的含量及其在大鼠体内的药动学特性。方法:首次建立HPLC-MS/MS法同时测定特女贞苷和蟛蜞菊内酯在二至方及大鼠血清和组织中的含量,再利用DAS 2.0程序分别计算其各自主要的药动学参数,并绘制血药浓... 详细信息

目的:阐明二至方中特女贞苷和蟛蜞菊内酯的含量及其在大鼠体内的药动学特性。方法:首次建立HPLC-MS/MS法同时测定特女贞苷和蟛蜞菊内酯在二至方及大鼠血清和组织中的含量,再利用DAS 2.0程序分别计算其各自主要的药动学参数,并绘制血药浓度-时间曲线。结果:特女贞苷和蟛蜞菊内酯的回归方程分别为Y=123.408+181.663X(R2=0.9999)、Y=92 127.2+3 822.94X(R2=0.9987),线性范围在25～1 000μg/L,LOD分别为2.04、2.60μg/L,提取回收率分别为101.2%和100.3%;二至方中特女贞苷的含量范围在0.27%～9.79%,蟛蜞菊内酯的含量范围在0.16%～0.61%;特女贞苷Tmax=1.50h,蟛蜞菊内酯Tmax=2.0h,蟛蜞菊内酯的Cmax=(30.24±1.65)μg/L,特女贞苷C_(max)=(6.39±0.05)μg/L,蟛蜞菊内酯的AUC(0-∞)=(123.30±2.68)μg·L^(-1)·h^(-1),特女贞苷AUC(0-∞)=(16.56±0.98)μg·L^(-1)·h^(-1)。结论:该法准确可靠,专属性强,适用于特女贞苷和蟛蜞菊内酯在中药复方、大鼠体内的药代动力学研究。

关键词：二至方特女贞苷蟛蜞菊内酯 HPLC-MS/MS 药动学

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二至方中三萜类成分的含量测定及在大鼠体内的药动学特征

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江苏大学学报（医学版） 2018年第4期28卷 328-332页

作者：汪华君蒋俊尹江宁江苏大学附属医院药剂科江苏镇江212001 江苏大学药学院江苏镇江212013 江苏大学附属医院急诊科江苏镇江212001

目的:探讨二至方中三萜类成分在大鼠体内的药动学特征。方法:建立HPLC法同时测定二至方中及二至方提取物灌胃后大鼠血浆和组织中三萜类代表性成分齐墩果酸和熊果酸的含量,绘制血药浓度-时间曲线,DAS2.0软件计算其药动学参数。结果:齐墩... 详细信息

目的:探讨二至方中三萜类成分在大鼠体内的药动学特征。方法:建立HPLC法同时测定二至方中及二至方提取物灌胃后大鼠血浆和组织中三萜类代表性成分齐墩果酸和熊果酸的含量,绘制血药浓度-时间曲线,DAS2.0软件计算其药动学参数。结果:齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别为Y=6.510 975 36X+2.180 605 9(R^2=0.999 78)、Y=5.412 280 24X-1.627 312 6(R2=0.999 18),线性范围均在0.5~50.0μg/m L,定量下限(LOD)分别为1.24和1.26μg/m L;二至方中齐墩果酸和熊果酸的回收率分别为99.8%和102.1%,血浆样品中齐墩果酸和熊果酸的提取回收率分别为82.15%和83.73%;7个批次的二至方中齐墩果酸和熊果酸含量范围分别为0.67%~4.26%和0.21%~1.19%;肝、心、脾、肺和肾组织中齐墩果酸的浓度分别为197.60、11.70、1.10、43.70和40.10mg/L,熊果酸的浓度分别为92.90、61.80、37.90、307.50和301.30 mg/L;齐墩果酸和熊果酸的达峰时间(T_(max))均为0.5 h,峰浓度(C_(max))分别为(111.33±10.50)mg/L和(153.72±3.35)mg/L,药时曲线下面积[AUC_(0-∞)]分别为(342.44±10.15)mg/(L·h)和(589.79±9.49)mg/(L·h),半衰期(t1/2z)分别为(2.93±0.03)h和(3.19±0.02)h。结论:该方法能检测二至方中三萜类成分在复方、血浆及组织中的含量。

关键词：二至方三萜类成分药动学高效液相色谱法

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