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定向进化二肽酶CpPepD及其在L-肌肽合成中的应用

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定向进化二肽酶CpPepD及其在L-肌肽合成中的应用

作者：张晓涵天津科技大学

学位级别：硕士

左旋肌肽(L-肌肽,L-Car)作为一种天然的生物活性二肽,广泛存在于各种脊椎动物的肌肉和脑组织中,具有抗氧化、抗糖基化和金属离子螯合等重要的生理功能。因此,L-Car在食品、医药及化妆品等领域具有广泛的应用前景。L-Car的制备方法分为... 详细信息

左旋肌肽(L-肌肽,L-Car)作为一种天然的生物活性二肽,广泛存在于各种脊椎动物的肌肉和脑组织中,具有抗氧化、抗糖基化和金属离子螯合等重要的生理功能。因此,L-Car在食品、医药及化妆品等领域具有广泛的应用前景。L-Car的制备方法分为化学法与酶法,化学法通常需要对氨基酸进行保护和脱保护,其反应步骤繁琐,反应条件苛刻。酶法合成L-Car的反应条件温和,操作简单,选择性好,是一种很有前途的合成方法。本文利用β-Ala-His二肽酶全细胞作为生物催化剂一步合成L-Car,并尝试对产物进行分离精制。本课题通过在NCBI GenBank数据库中搜索β-Ala-His二肽酶进行酶的挖掘。经过酶活力的检测,发现CpPepD具有最高的L-Car合成活性,该酶来源于产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),分子量为53.8 KDa。CpPepD可以特异性催化β-丙氨酸(β-Ala)和L-组氨酸(L-His)一步合成L-Car,反应过程中不需要添加昂贵的ATP且没有副产物产生。CpPepD经同源建模和模拟Docking后,选择L-Car结合位点6?范围内的29个氨基酸进行单位点饱和突变,期望获得更高活性的酶。首先用荧光光度法对突变体库进行第一轮的筛选,再用高效液相色谱法复筛获得了四个水解活性提高的突变体A171S、E172V、H254R和V456A。通过检测其比酶活,发现突变体A171S的合成活性最高,提高到野生型的2.2倍。通过模拟突变和分子对接,从分子水平推测其活性的改变可能与活性中心的亲疏水环境的变化有关。对CpPepD和突变体A171S的酶学性质进行系统的研究,并优化了突变体A171S催化L-Car的合成条件。在最优条件下,突变体A171S全细胞在10 h内可以催化合成65.5 mM的L-Car。随后,对野生型和突变体进行了固定化来提高酶的稳定性和重复使用率,然而并未达到预期效果。最后,尝试将合成反应做了初步放大,结合乙醇沉淀和膜分离技术将产物分离纯化,得到了含量为31%的L-Car。总之,本研究通过基因挖掘、筛选和分子改造获得了催化活性较高的二肽酶CpPepD及其优良突变体A171S,对该突变体酶学性质的研究表明其具有潜在的工业应用价值。

关键词： L-肌肽生物活性二肽二肽酶固定化膜分离

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二肽酶Ⅳ的结构与功能

生命的化学 2001年第5期21卷 381-384页

作者：张志珍毛积芳刘智慧第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 太原市科学技术协会太原030003

二肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPPⅣ;EC3.***.14.5/CD26)是由Hopsu-Havu和Glenner在鼠肝脏组织匀浆过程中发现的,它能从甘氨酰-脯氨酰-2-萘酰胺(gly-Pro-2-naphthylamide)底物中水解2-萘酰胺,最初被称为甘氨酰脯氨酸萘酰胺酶(glycylpro line naphthlamidase),后被证明广泛存在于肾脏、胃肠道、结缔组织、淋巴结等组织中,唾液及血液中也含有此酶.凡N末端数第二位上存在脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是该酶发挥活性的主要底物,DPPⅣ能从肽链的N末端水解两个氨基酸残基Xaa-Pro或Xaa-Ala,从而使哺乳动物体内的许多生物活性肽部分或完全失去与其受体的结合.哺乳动物体内DPPⅣ的重要底物包括神经肽、循环肽激素、趋化因子等.

关键词： DDPⅣ 分子结构功能二肽酶趋化因子

利用计算机分析鉴定来源于肉蛋白的二肽酶-Ⅳ和血管紧张素-Ⅰ转化酶抑制多肽

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中国医药工业杂志 2015年第4期46卷 438-438页

作者： Lafarga T 夏江华

血管紧张素-Ⅰ转化酶（ACE-Ⅰ,EC 3.***.15.1）、肾素（EC 3.***.23.15）和二肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ,EC 3.***.14.5）在高血糖的控制、2型糖尿病和其他代谢综合症相关疾病的发展中起重要作用。本研究利用已知的计算机方法、多肽数据库和软件。

关键词：二肽酶血管紧张素肉蛋白代谢综合症计算机分析高血糖肾素转化酶酶抑制计算机方法

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肾二肽酶的克隆

生物技术通报 1991年第5期7卷 15-15页

作者：孙国凤

藤泽药品工业公司分离出能用于??系抗生物质的筛选系的人和猪肾二肽酶(RDP)的cDNA,用动物细胞表达成功,并已在日本生化学会报告.这一类抗生物质对从葡萄球菌等革兰氏阴性菌到绿浓菌等革兰氏阴性菌的广范围的细菌都有很强的抗菌力.但是... 详细信息

藤泽药品工业公司分离出能用于??系抗生物质的筛选系的人和猪肾二肽酶(RDP)的cDNA,用动物细胞表达成功,并已在日本生化学会报告.这一类抗生物质对从葡萄球菌等革兰氏阴性菌到绿浓菌等革兰氏阴性菌的广范围的细菌都有很强的抗菌力.但是在活体中RDP常立即被分解.所以尿道感染症不能使用.表达RDP的动物细胞在不被RDP分解的抗生物质筛选上发挥作用.

关键词：二肽酶抗生抗菌力生化学药品工业猪肾感染症同源性残基构成氨基酸序列

Periocheck椅旁快速检测对牙周治疗效果的评价

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实用口腔医学杂志 2001年第1期17卷 34-36页

作者：张贤华吴织芬西安第四军医大学口腔医院 710032

目的 :利用 Periocheck椅旁快速检测观察牙周治疗前后龈下菌斑肽酶活性的改变及其与牙周临床指标的相关性。方法 :利用 Periocheck椅旁快速检测 6 5例牙周炎患者共 6 5个位点洁治前后龈下菌斑中牙龈卟啉菌、福塞类杆菌、齿垢密螺旋体来... 详细信息

目的 :利用 Periocheck椅旁快速检测观察牙周治疗前后龈下菌斑肽酶活性的改变及其与牙周临床指标的相关性。方法 :利用 Periocheck椅旁快速检测 6 5例牙周炎患者共 6 5个位点洁治前后龈下菌斑中牙龈卟啉菌、福塞类杆菌、齿垢密螺旋体来源的肽酶活性的改变 ,通过与标准比色卡比较区分阳性和阴性 ;在6 6 6 nm下测吸光度值 ,定量反映肽酶活性。结果 :治疗前牙周炎位点肽酶活性 (0 .44± 0 .2 3)明显高于治疗后 (0 .34± 0 .2 6 ) ,差异有显著性 (P肽酶活性 ,反映牙周临床指标的改变。

关键词：二肽酶 PERIOCHECK 牙周炎牙科刮治术

血管紧张素转换酶与高血压的关系以及高血压的酶抑制剂疗法

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生命的化学(中国生物化学会通讯) 1986年第6期 10-13页

作者：陈兰英中国医学科学院心血管病研究所北京

血管紧张素转换酶(肽基二肽酶,peptidyl dipeptidase,EC 3.***.15.1)(angiotensin converting enzyme,简称ACE)是含锌的金属蛋白酶。它能从羧基末端水解掉天然底物——血管紧张素Ⅰ(天-精-缬-酪-异亮-组-脯-苯丙-组-亮,十肽)(angotensin Ⅰ,简称AⅠ)的一个二肽(组-亮),使其转变为血管紧张素Ⅱ(八肽)(angiotensin Ⅱ,简称AⅡ)。自从1956年Skeggs等首先在马血浆中发现ACE后,约有十多年未开展这方面的研究。1966年大岛发

关键词：酶抑制剂血管紧张素Ⅰ converting peptidyl 二肽酶金属蛋白酶血管紧张素Ⅱ 十肽肾素羧基末端

Glenmark公司的Melogliptin即将进入Ⅲ期临床试验

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国外药讯 2009年第7期 14-14页

在最近为期12周纳入494名2型糖尿病患者的Ⅱb期临床试验中，Glenmark公司的新型降糖药二肽酶4抑制剂（DPP-4）Melogliptin（Ⅰ）改善了2型糖尿病患者的血糖控制，并显示出显著的安全性和耐受性。此外，服用（Ⅰ）的患者低血糖的发生率... 详细信息

在最近为期12周纳入494名2型糖尿病患者的Ⅱb期临床试验中，Glenmark公司的新型降糖药二肽酶4抑制剂（DPP-4）Melogliptin（Ⅰ）改善了2型糖尿病患者的血糖控制，并显示出显著的安全性和耐受性。此外，服用（Ⅰ）的患者低血糖的发生率较低，体重无明显变化。

关键词： Ⅲ期临床试验 2型糖尿病患者血糖控制 Ⅱb期抑制剂二肽酶降糖药耐受性

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谈高中生物学课本中的“肽酶”概念

生物学教学 2000年第11期25卷 43-43页

作者：谷红江苏省六合县第一中学 211500

高中《生物》(必修本)" 动物新陈代谢"一节中提到在食物消化过程中起重要作用的几种酶的名称,人们通常从这些酶的名称上能看出它们来源于什么消化腺,但其中"肽酶" 一词不能说明它的来源,这常常引起学生的疑问.笔者发现有些教师对肽酶来... 详细信息

高中《生物》(必修本)" 动物新陈代谢"一节中提到在食物消化过程中起重要作用的几种酶的名称,人们通常从这些酶的名称上能看出它们来源于什么消化腺,但其中"肽酶" 一词不能说明它的来源,这常常引起学生的疑问.笔者发现有些教师对肽酶来源问题也缺乏了解,不少情况下给予学生的回答就是:肽酶就是肠肽酶,来源于小肠腺.

关键词：高中生物学高中《生物》氨基酸二肽酶小肠腺肠肽酶消化道课本胰糜蛋白酶胃蛋白酶