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基于悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)安全性和免疫产生期研究

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中国家禽 2023年第1期45卷 32-37页

作者：沈佳赵蕾习硕史爱华李林靳换章振华张建伟北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097

为探讨悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)(以下简称二联灭活疫苗)的安全性和免疫产生期,试验用新城疫病毒(NDV)La Sota株和H9亚型禽流感病毒(AIV)BX13株分别接种BHK-21和MDCK悬浮细胞,收获抗原液,制... 详细信息

为探讨悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)(以下简称二联灭活疫苗)的安全性和免疫产生期,试验用新城疫病毒(NDV)La Sota株和H9亚型禽流感病毒(AIV)BX13株分别接种BHK-21和MDCK悬浮细胞,收获抗原液,制备二联灭活疫苗;采用1 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡进行二联灭活疫苗的安全性试验;以0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIVHI抗体,并于免疫后21日龄攻毒进行免疫保护试验和免疫产生期试验。结果显示:二联灭活疫苗对SPF鸡安全,鸡只无不良反应,疫苗吸收良好;各剂量组免疫后抗体水平均逐渐升高,免疫后21 d NDV HI效价为6.1~8.5 log2,AIV HI效价为7.5~11.2 log2;免疫后21 d,0.02 mL/只剂量组对两种毒株的攻毒保护率均为9/10,其余剂量组均为10/10保护。研究表明,二联灭活疫苗对SPF鸡安全,以0.1 mL/只的剂量免疫SPF鸡21 d可获得对NDV和H9 AIV的有效抵抗。

关键词：鸡新城疫 H9亚型禽流感悬浮培养二联灭活疫苗安全性免疫产生期

传染性法氏囊病病毒-禽腺病毒血清4型重组二联灭活疫苗的免疫效力研究

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传染性法氏囊病病毒-禽腺病毒血清4型重组二联灭活疫苗的免疫效力...

作者：侯文飞河南农业大学

学位级别：硕士

由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）和禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAd V-4）新基因型引起的鸡肝炎-心包积液综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS）是严重影响我国养禽业的两种重要传染病。更为严重的是,IBDV不断变异,尤其是引起法氏囊严重萎缩的变异毒株的出现,导致现有疫苗的免疫效力降低。IBDV和FAd V-4混合感染将造成更加严重的后果。现有的IBD-HHS多联疫苗存在生产成本高、制苗工艺繁琐等缺陷,因此,研制能够同时防控IBDV变异株和FAd V-4感染的新型高效疫苗具有重要意义。本论文评价了基于表达IBDV变异株VP2蛋白的重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2制备二联灭活疫苗的免疫原性和免疫效力,包括以下几个方面的内容:1.疫苗制备用重组病毒r FAd V-4-IBDV/VP的扩增与鉴定为了制备廉价、高效的新型IBD-HHS二联灭活疫苗,团队前期构建了表达IBDV变异株VP2蛋白的禽腺病毒血清4型重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2。本部分研究首先对该重组病毒的体外复制特性进行了再次评价;利用聚合酶链式反应（PCR）、序列测定和Western blot等方法对扩增的用于疫苗制备用重组病毒进行了鉴定。结果显示,重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2在鸡肝癌上皮细胞系（LMH）中的复制良好。IBDV VP2基因插入的位置和方向均正确,VP2蛋白得到高效表达。纯净性试验证明重组病毒符合制备疫苗的要求。2.基于IBDV变异株VP2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立为了客观评价重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2所诱导的抗IBDV变异株的抗体反应和检测IBDV变异株的流行情况,本试验建立了检测IBDV变异株特异性抗体的间接ELISA方法。将IBDV变异株VP2蛋白的编码基因按照大肠杆菌喜好密码子优化合成并克隆到原核表达载体p ET32a中,在大肠杆菌中进行诱导表达。用纯化的VP2蛋白作为包被抗原,经过试验条件优化,建立了检测抗IBDV抗体的间接ELISA方法。试验结果证明,该方法可以检测抗IBDV特异性抗体,与新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、FAd V-4、H5/H7/H9亚型禽流感病毒等禽病病毒的抗血清均无交叉反应,所建立ELISA的批间和批内重复试验的变异系数分别为0.32%～5.66%和1.92%～4.81%,表明重复性良好。所建立ELISA的临床应用评价显示被检地区养殖场均存在不同程度的抗IBDV抗体阳性,平均阳性率为63.67%。所建立的ELISA方法可以用于抗IBDV抗体的检测,为IBD疫苗免疫原性评价和IBDV流行病学调查提供了方法。3.基于重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2的灭活油乳剂疫苗的免疫原性和免疫效力评价为了评价基于重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2的灭活油乳剂疫苗的免疫原性和免疫效力,对2周龄的无特定病原体（SPF）鸡通过肌肉注射途径免疫灭活r FAd V4-IBDV/VP2油乳剂疫苗,利用建立的IBDV间接ELISA抗体检测方法检测疫苗免疫后的抗IBDV抗体水平,利用FAd V-4间接ELISA抗体检测方法检测抗FAd V-4抗体。结果显示,灭活r FAd V4-IBDV/VP2油乳剂疫苗免疫后21 d均可诱导机体产生高水平的抗IBDV和抗FAd V-4特异性抗体。攻毒试验结果显示,灭活r FAd V4-IBDV/VP2油乳剂疫苗对IBDV强毒变异株和高致病性FAd V-4株的攻毒提供完全保护。研究结果显示,重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2可以用于制备防控鸡传染性法氏囊病和鸡肝炎-心包积液综合征的廉价、高效二联疫苗。

关键词：传染性法氏囊病肝炎-心包积液综合征重组禽腺病毒血清4型传染性法氏囊病病毒VP2蛋白间接ELISA 二联灭活疫苗

牛支原体、A型巴氏杆菌二联灭活疫苗模型动物免疫保护性评价

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牛支原体、A型巴氏杆菌二联灭活疫苗模型动物免疫保护性评价

作者：李轩宇吉林农业大学

学位级别：硕士

牛呼吸道疾病综合征(Bovine Respiratory Disease,BRD)是危害肉牛产业的重要疾病,其主要病原为牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(P.multocida)等,其中,由M.bovis、P.multocida混合感染引发的BRD具有更高的发病率、死亡率,给肉牛产业以及“政银担保联盟”造成了巨大经济损失。目前,针对M.bovis、P.multocida引发的疾病主要采用抗菌药物进行治疗,但随着药物的不合理使用,已导致这两种致病菌对常用药物产生了耐药性,因耐药性造成的抗感染失败已屡见不鲜。筛选获得免疫原性好的疫苗候选菌株,研发M.bovis、P.multocida二联灭活疫苗,是有效预防M.bovis、P.multocida混合感染的重要策略。为此,本研究对课题组已筛选获得的生产用、检验中菌株进行验证,建立二联苗原始、基础和生产用种子批,制备M.bovis、P.multocida二联灭活疫苗,并采用模型动物对二联灭活疫苗的免疫保护性进行测定,主要试验内容如下:(1)基于课题组前期筛选获得的检验用M.bovis CC200910株、Mb1株和P.multocida YT150616株进一步对其毒性进行确证,建立家兔感染模型,分别设M.bovis CC200910株感染组、M.bovis Mb1株感染组、P.multocida YT150616株感染组以及空白对照组。通过临床观察、饮食情况、肺脏评分及致死率判定等实验证明M.bovis CC200910株(4.04分)和P.multocida YT150616株(致死率达75%)具有较强毒力,可作为二联苗检验用菌株。(2)基于课题组已筛选获得的疫苗用菌株M.bovis TL140428株和P.multocida YT150616株,本研究采用冷冻干燥技术对两株疫苗用菌株的原始、基础、生产用种子批进行建立,对M.bovis TL140428株和P.multocida YT150616株种子批的纯粹性、安全性及免疫原性等进行测定,结果显示,上述种子批均符合标准,为M.bovis、P.multocida二联灭活疫苗的制备提供了保障。(3)采用M.bovis TL140428株和P.multocida YT150616株生产用种子制备二联灭活疫苗,通过M.bovis CC200910株和P.multocida YT150616株检验用种子建立的家兔感染模型对二免灭活苗的免疫保护性进行评价,采用5.5分制对M.bovis感染肺脏病变程度进行评分,统计P.multocida感染家兔模型的致死率。结果显示,二联灭活疫苗对M.bovis CC200910株的保护率为73.4%,对P.multocida YT150616株的保护率为87.5%,说明制备的二联灭活疫苗具备良好的免疫保护力,为后期靶动物试验奠定了坚实基础。

关键词：牛支原体牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌种子批二联灭活疫苗

小反刍兽疫和山羊痘二联灭活疫苗的制备及其免疫原性

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中国草食动物科学 2023年第3期43卷 14-20页

作者：应普红刘艳芬陈绍红刘铀广东海洋大学滨海农业学院湛江524088 广东海洋大学食品科技学院湛江524088

为了研制小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)和山羊痘(Goat pox,GTP)二联油剂灭活疫苗,以Vero细胞增殖小反刍兽疫病毒Nigeria75/1 Clone 9株和山羊痘病毒CVCC AV41株,通过细胞病变观察、间接免疫荧光试验和荧光定量PCR确定接... 详细信息

为了研制小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)和山羊痘(Goat pox,GTP)二联油剂灭活疫苗,以Vero细胞增殖小反刍兽疫病毒Nigeria75/1 Clone 9株和山羊痘病毒CVCC AV41株,通过细胞病变观察、间接免疫荧光试验和荧光定量PCR确定接种方式、接毒剂量和收毒时间对病毒增殖的影响。采用细胞病变观察、SDS-PAGE和Western-blot比较甲醛、二乙烯亚胺和β-丙内酯灭活病毒的效果。随后在灭活的病毒悬液中加入等体积的油佐剂进行乳化,制备PPRV-GTPV二联油剂灭活疫苗,并参照《中国兽药典》检测疫苗理化性状。为评价疫苗的免疫原性,将24只2月龄临床健康的雷州山羊随机分为3组(每组8只),分别肌肉注射生理盐水、PPRV-GTPV二联灭活疫苗、商品化PPRV-GTPV弱毒疫苗。免疫后14 d和28 d分别检测试验山羊血清PPRV和GTPV中和抗体。结果表明,PPRV和GTPV以100 TCID50/mL的剂量共感染Vero细胞84 h后的病毒滴度较高。用终浓度为0.025%的β-丙内酯4℃处理24 h,能有效灭活PPRV和GTPV;制备的灭活疫苗符合《中国兽药典》相关要求。PPRV和GTPV二联灭活疫苗免疫14 d后,山羊血清PPRV和GTPV中和抗体水平与商品化弱毒疫苗相仿;免疫28 d后,山羊血清PPRV中和抗体显著高于商品化弱毒疫苗,GTPV抗体呈上升趋势,但显著低于商品化弱毒疫苗。试验山羊均未见明显不良反应。综上说明,PPRV-GTPV二联灭活疫苗安全、有效,有望在小反刍兽疫和山羊痘的防制中发挥重要作用。

关键词：小反刍兽疫山羊痘二联灭活疫苗免疫原性

绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗的免疫效力研究

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中国兽医科学 2021年第9期51卷 1155-1162页

作者：张静李敏高强杨茹刘少蓉张伟段跃强内蒙古华希生物科技有限公司内蒙古呼和浩特010111

为了评价本项目组自制的绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗的免疫效力,取制备的绵羊肺炎支原体SH-01株及鹦鹉热衣原体重组MOMP蛋白抗原等体积混合后与ISA201佐剂乳化制成灭活疫苗(至少含SH-01株2×10^(8)CCU/m L;重组MOMP蛋白0.3 ... 详细信息

为了评价本项目组自制的绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗的免疫效力,取制备的绵羊肺炎支原体SH-01株及鹦鹉热衣原体重组MOMP蛋白抗原等体积混合后与ISA201佐剂乳化制成灭活疫苗(至少含SH-01株2×10^(8)CCU/m L;重组MOMP蛋白0.3 mg/m L),在配种前15 d免疫健康母绵羊,免疫21 d后采血分离血清分别测定抗绵羊肺炎支原体和抗鹦鹉热衣原体的特异抗体效价;免疫45 d后用绵羊肺炎支原体SH-01株和鹦鹉热衣原体CG1株进行攻毒试验。结果显示,免疫后绵羊肺炎支原体血凝抗体效价高达1∶64,鹦鹉热衣原体ELISA抗体效价高达1∶4850;绵羊肺炎支原体和鹦鹉热衣原体强毒株攻毒后保护率均可达到100%,表明此绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。

关键词：绵羊肺炎支原体鹦鹉热衣原体二联灭活疫苗免疫保护

猪脑心肌炎与猪圆环病毒病二联灭活疫苗的研制和免疫效力

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中国兽医学报 2017年第1期37卷 66-72,77页

作者：刘慧敏常洪涛杨霞贺秀媛陈陆王新卫李永涛赵军王川庆河南农业大学生命科学学院河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

研制了猪脑心肌炎(EMCV)与猪圆环病毒(PCV-2)二联灭活疫苗EMCV/PCV-2,并选择小鼠和猪进行疫苗的安全性与免疫效力试验。结果显示:EMCV/PCV-2二联灭活疫苗对小鼠、仔猪、后备母猪和不同妊娠阶段母猪均安全。免疫小鼠时的最佳接种剂量为0.... 详细信息

研制了猪脑心肌炎(EMCV)与猪圆环病毒(PCV-2)二联灭活疫苗EMCV/PCV-2,并选择小鼠和猪进行疫苗的安全性与免疫效力试验。结果显示:EMCV/PCV-2二联灭活疫苗对小鼠、仔猪、后备母猪和不同妊娠阶段母猪均安全。免疫小鼠时的最佳接种剂量为0.1mL,首免和二免的保护率分别高达80%和100%,免疫效果均高于相应单苗,并可产生各自的高水平抗体;免疫仔猪时的最佳接种剂量为2mL,免疫效果略高于相应单苗和PCV-2商品苗,且平均日增重最高,料肉比最低,攻毒保护试验结果表明可完全有效抵抗EMCV和PCV-2强毒株的攻击。该疫苗为2种疾病的联合免疫提供了可能,达到"一针防两病"的效果,满足了EMCV免疫的潜在需求。

关键词：猪圆环病毒2型脑心肌炎病毒二联灭活疫苗免疫效力

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猪链球菌病二联灭活疫苗的研制

南京农业大学学报 2003年第1期26卷 70-73页

作者：王建刘佩红陆承平王永康张苏华沈素芳沈莉萍南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 上海市畜牧兽医站上海201103

以马链球菌兽疫亚种 (Stretococcusequisubsp zooepidemicus)ATCC35 2 4 6株和猪链球菌 2型 (S suistype 2 )HA980 1株作为生产菌株 ,制备氢氧化铝胶二联灭活疫苗。经过无菌及安全检验合格 ,肌肉接种仔猪 ,每头 2mL。免疫15d后 ,对HA98... 详细信息

以马链球菌兽疫亚种 (Stretococcusequisubsp zooepidemicus)ATCC35 2 4 6株和猪链球菌 2型 (S suistype 2 )HA980 1株作为生产菌株 ,制备氢氧化铝胶二联灭活疫苗。经过无菌及安全检验合格 ,肌肉接种仔猪 ,每头 2mL。免疫15d后 ,对HA980 1和ATCC35 2 4 6的保护率分别为 10 0 % (2 6 / 2 6 )和 92 3% (2 4 / 2 6 )。用二联灭活苗免疫后 4周内仔猪体内抗体水平持续上升 ,从第 5周开始逐渐下降 ;再次免疫后 ,抗体水平迅速回升 ,12 0d后仍维持较高水平。攻毒保护试验和抗体消长规律的测定显示 ,制备的猪链球菌病二联灭活苗具有良好的免疫保护作用。

关键词：猪链球菌病二联灭活疫苗抗体

小鹅瘟-鹅副黏病毒病二联油乳剂灭活疫苗的研究

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中国畜牧兽医 2012年第8期39卷 189-194页

作者：李琳姚新华邵洪泽尹荣兰任科研许志林吉林省畜牧兽医科学研究院吉林长春130062

为了有效防制小鹅瘟和鹅副黏病毒病对雏鹅的危害,分别选用免疫原性良好的小鹅瘟JLDA株和鹅副黏病毒JLSY株制作抗原液,应用PALL浓缩技术进行浓缩,保证灭活病毒抗原含量足,比例均衡。选取10号白油佐剂,按油相与水相比1∶1配制成复相制备... 详细信息

为了有效防制小鹅瘟和鹅副黏病毒病对雏鹅的危害,分别选用免疫原性良好的小鹅瘟JLDA株和鹅副黏病毒JLSY株制作抗原液,应用PALL浓缩技术进行浓缩,保证灭活病毒抗原含量足,比例均衡。选取10号白油佐剂,按油相与水相比1∶1配制成复相制备二联灭活苗,黏稠度低。结果显示,对鹅的免疫效力不低于相应单苗,两种病毒之间没有交互抑制作用,且二联灭活苗安全性能好,疫苗吸收良好。种、雏鹅产生抗体快,免疫种、雏鹅,具有产生免疫力早,保护期长等特点,于2～8℃至少保存12个月。

关键词：小鹅瘟鹅副黏病毒二联灭活疫苗

猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征二联灭活疫苗免疫效力

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中国兽医学报 2010年第5期30卷 573-576,606页

作者：金扩世韩松鲁会军李洋杨尧李昌李霄田明尧金宁一军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

利用猪圆环病毒病(PCVD)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)二联灭活疫苗免疫4周龄仔猪,免疫后7、14、21、28d采血,测定免疫后血清中抗PRRSV、PCV中和抗体和ELISA抗体较价,并于免疫后28d分别用PRRSV和PCV2攻毒,攻毒后每日检测猪体温和观察临床... 详细信息

利用猪圆环病毒病(PCVD)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)二联灭活疫苗免疫4周龄仔猪,免疫后7、14、21、28d采血,测定免疫后血清中抗PRRSV、PCV中和抗体和ELISA抗体较价,并于免疫后28d分别用PRRSV和PCV2攻毒,攻毒后每日检测猪体温和观察临床症状,于攻毒后21d所有存活猪全部扑杀,分别对每头猪肺、肝、脾、淋巴结、心和血进行剖解病理和组织病理学观察及PRRSV和PCV2核酸检测,以确定该疫苗免疫保护率。结果表明,所有试验猪于免疫后7d血清抗体开始检出,28d达到峰值,免疫后28dPRRSV和PCV2攻毒保护率均为100%(5/5)。

关键词： PRRSV PCV2 二联灭活疫苗效力试验