检索结果-南通市图书馆

作者：王宇扬州大学

学位级别：硕士

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)属于柔膜体纲支原体属,主要感染鸡和火鸡,能导致家禽关节肿大、滑液囊及腱鞘发炎和实质器官的肿大,在国内外感染严重。目前普遍认为MS感染机体后,能以各种方式黏附于宿主上皮细胞。许多支原体中与代... 详细信息

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)属于柔膜体纲支原体属,主要感染鸡和火鸡,能导致家禽关节肿大、滑液囊及腱鞘发炎和实质器官的肿大,在国内外感染严重。目前普遍认为MS感染机体后,能以各种方式黏附于宿主上皮细胞。许多支原体中与代谢相关的酶类已经被发现不仅分布于细胞质中发挥生物催化功能,同时分布于细胞膜表面,参与黏附宿主细胞,发挥致病作用。二氢硫辛酸脱氢酶(Dihydrolipoamidedehydrogenase,DLD)是一种黄素蛋白氧化还原酶,目前关于MS的DLD的相关研究很少,在本实验中对MS的DLD的生物学功能及其黏附特性进行了研究,为进一步探索MS的致病机理提供了分子基础。1.滑液支原体DLD的原核表达及蛋白纯化参照NCBI中GenBank的MS WVU1853菌株的dld基因碱基序列,设计特异性引物,经Overlap PCR对基因进行点突变后,将获得的突变后序列克隆至平末端载体pLB,经测序验证成功后连接表达载体pET-28a(+),IPTG诱导表达后原核表达显示重组MSDLD(rMSDLD)表达在上清,用His-tag蛋白纯化磁珠对表达在上清中的rMSDLD进行纯化,得到纯化的rMSDLD蛋白。2.滑液支原体DLD的酶促动力学反应的测定因二氢硫辛酸脱氢酶是一种代谢酶,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,NADH失去H+生成NAD+,用酶标仪连续监测底物NADH的量来显示rMSDLD的酶促活性。结果显示DLD具有一定的酶活性,其比活力为3.6 U/mg,最适pH为7.0、最适反应温度为250C,双倒数作图法求出其公式为y=4.55x+0.1956(R2=0.9973),并求得rMSDLD的米氏常数Km(NADH)为23.2 μmol/L,最大反应速率Vmax为5.1 μmol/(L·min)。3.滑液支原体DLD的免疫原性、亚细胞定位检测利用MS鸡阳性血清作为一抗进行Western-blot检测该蛋白的免疫原性。利用rMSDLD蛋白制备鼠多克隆抗体和兔多克隆抗体,并用ELISA法检测其效价。然后用试剂盒提取MS膜蛋白和胞浆蛋白,利用制备的抗rMSDLD鼠血清作为一抗进行Western-blot反应检测其亚细胞定位情况,同时进行悬浮免疫荧光实验来确证rMSDLD蛋白是否分布于MS膜表面。接下来进行动物实验,对蛋白的免疫保护性进行了评价,同时进行血清介导的补体杀菌实验。免疫原性检测结果发现鸡阳性血清能够别到0.1μg的rMSDLD蛋白,并且条带的亮度与蛋白使用剂量呈正相关,证明蛋白具有较好的免疫原性。制备的鼠多克隆抗体、兔多克隆抗体利用ELISA法检测到其血清效价达到2048000、1024000。用制备的鼠抗rMSDLD血清检测该蛋白在MS中的亚细胞定位情况,发现该蛋白主要存在于MS的胞浆蛋白中,少量分布于MS膜组分中;悬浮免疫荧光证实该蛋白存在于MS膜表面。然后制备rMSDLD蛋白疫苗免疫SPF鸡,MS攻毒后发现rMSDLD蛋白免疫能显著降低鸡只发病程度,具有一定的免疫保护力。抗rMSDLD血清介导的补体杀菌效力达到88.50%,与支原体结合后能够有效激活补体,进而表现出良好的杀菌效果。4.滑液支原体DLD的粘附特性研究利用间接免疫荧光和ELISA实验检测rMSDLD与鸡成纤维细胞DF-1的黏附反应,同时检测抗rMSDLD兔血清对其黏附的抑制作用,结果发现rMSDLD能特异性的黏附到DF-1细胞上,且黏附能被抗rMSDLD兔血清显著性抑制。然后利用Western-blot法和ELISA法检测该蛋白与胞外基质蛋白鸡纤溶酶原(Chickenplasminogen,cPlg)的黏附反应,结果发现rMSDLD蛋白与胞外基质蛋白cPlg黏附明显。

关键词：滑液支原体二氢硫辛酸脱氢酶酶学活性亚细胞定位免疫保护性黏附特性

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牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及缺失株的构建

牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及缺失株的构建

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作者：李娜甘肃农业大学

学位级别：硕士

牛支原体是牛呼吸系统的常见病原微生物,除导致牛呼吸系统严重疾病外,还可引起关节炎、角膜炎等一系列次生机能障碍。二氢硫辛酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶复合体重要组成部分,在生物体的能量代谢途径中发挥重要作用,但目前关于牛支原体二氢... 详细信息

牛支原体是牛呼吸系统的常见病原微生物,除导致牛呼吸系统严重疾病外,还可引起关节炎、角膜炎等一系列次生机能障碍。二氢硫辛酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶复合体重要组成部分,在生物体的能量代谢途径中发挥重要作用,但目前关于牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶的相关研究较为少见。因此,开展牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶相关的研究以期在丰富牛支原体研究内容的同时,也能极大地促进牛支原体相关诊断试剂和疫苗的开发。1.牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶的原核表达及其多克隆抗体的制备参照GeneBank中牛支原体PG45株中的pdhd基因序列设计一对特异性引物,通过PCR扩增获得牛支原体武威株pdhd基因并将其克隆至pMD19-T载体,在序列测定的基础上以Overlap PCR完成基因优化后,与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-pdhd,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后成功获得融合蛋白His-DLD,再经SDS-PAGE电泳鉴定为上清表达;纯化后的表达产物His-DLD免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,并通过ELISA检测抗体效价。结果表明,重组融合蛋白His-DLD多抗血清与纯化后的原核表达产物His-DLD可发生特异性结合反应。2.重组蛋白二氢硫辛酸脱氢酶比活性的测定应用连续监测法对pdhd基因原核表达产物His-DLD的酶促活性进行了测定,结果表明表达产物His-DLD在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,具有二氢硫辛酸脱氢酶活性,其最适反应温度为25℃、pH为7.5;双倒数作图法求出其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率(V max)为25.6μmol/(L·min)。3.牛支原体pdhd基因缺失株的构建从牛支原体武威株基因组扩增pdhd基因的上下游同源臂,通过Overlap PCR与含启动子的庆大霉素抗性基因(Genr)融合,再与pUC19载体连接,构建重组缺失质粒pUC△pdhd。将重组质粒pUC△pdhd电转化导入牛支原体武威株感受态细胞中,在庆大霉素抗性压力筛选下,重组质粒pUC△pdhd与野生株的染色体发生了同源重组,Genr基因取代pdhd基因,从而获得牛支原体pdhd基因缺失株。本研究结果可为深入研究牛支原体的能量代谢及二氢硫辛酸脱氢酶的其他生物学功能提供科学依据,也为进一步深入探索牛支原体的致病机理奠定基础。

关键词：牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶酶活性基因缺失

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基于化学成分差异的不同干燥方式熊胆粉镇痛作用研究

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中草药 2021年第18期52卷 5569-5580页

作者：杨俊莉钟林江雷阳邓妍高天赐徐玉玲刘涛张坤成都大学药学院四川成都610106 成都大学食品与生物工程学院四川成都610106 成都柏瑞泰生物科技有限公司四川成都610106 四川省抗病毒中药产业化工程技术研究中心四川成都610106

目的采用超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS)方法鉴定常压及减压干燥熊胆粉的化学成分,明确其差异成分,并以网络药理学理念为指导,探索熊胆粉镇痛作用机制。方法基于UPLC-MS/MS检测平台、数据库以及多元统计分析相结... 详细信息

目的采用超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS)方法鉴定常压及减压干燥熊胆粉的化学成分,明确其差异成分,并以网络药理学理念为指导,探索熊胆粉镇痛作用机制。方法基于UPLC-MS/MS检测平台、数据库以及多元统计分析相结合的手段研究熊胆粉的化学成分差异;借助PharmMapper、Uniprot、GeneCards数据库及文献,获取熊胆粉成分和病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的作用靶点,并采用动物试验对其药效进行验证;对疾病靶标-药物靶标集做拓扑分析获得核心靶标,并进行基因本体(GO)功能和基因与信号通路分析(KEGG)通路富集,通过Cytoscape3.8.2软件构建成分-靶标-通路网络图。结果常压干燥、减压干燥熊胆粉共有成分721个,差异成分8个(L-焦谷氨酸、鸟苷5′-单磷酸水合物、5,6-二氢胸腺嘧啶、7-甲基黄嘌呤、左旋甲状腺素、甲基间酪氨酸、大黄素8-葡萄糖苷、益母草碱),搜索得到差异成分潜在靶点共1605个;检索得到病毒性肝炎靶点7444个、胆囊炎靶点636个、冠心病靶点7563个;熊胆粉对病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的共同靶点有282个,GO功能富集分析得到GO条目759个(P二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase,DLD)、过氧化氢酶(atalase,CATC)及一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)等靶点,调节代谢通路和癌症通路等信号通路发挥其镇痛作用。药效试验结果表明常压、减压干燥熊胆粉均对热板及醋酸所致小鼠疼痛有抑制作用,且减压组镇痛作用强于常压组,有显著性差异(P<0.05)。结论干燥方式使得熊胆粉化学成分变异,从而导致其镇痛作用差异,初步探索了熊胆粉镇痛作用的机制,建议大生产中采用减压干燥制备熊胆粉,为熊胆粉合理应用提供了一定依据。

关键词：熊胆粉干燥方式差异成分镇痛作用网络药理学超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS) 常压干燥减压干燥 L-焦谷氨酸鸟苷5′-单磷酸水合物 5,6-二氢胸腺嘧啶 7-甲基黄嘌呤左旋甲状腺素甲基间酪氨酸大黄素8-葡萄糖苷益母草碱二氢硫辛酸脱氢酶过氧化氢酶一氧化氮合酶2

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丙酮酸脱氢酶复合体的作用机理及其临床意义

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动物医学进展 1981年第1期 1-4页

作者：张喜南

丙酮酸的氧化脱羧反应是一切需氧生物体糖、蛋白质和脂肪彻底氧化分解,放出能量,供给机体生理功能之需要的关键步骤。早在1936年Petens就提出,硫胺素在丙酮酸的氧化过程中起重要的作用。而后,

关键词：硫辛酸脱氢酶催化辅基 FAD 辅酶脱气丙酮酸脱氢酶复合体二氢硫辛酸脱氢酶作用机理临床意义

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