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肠球菌对二化螟Cry1Ca敏感性的调控机制研究

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肠球菌对二化螟Cry1Ca敏感性的调控机制研究

作者：李倩文中国农业科学院

学位级别：硕士

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌。由于其独特的杀虫活性,已被广泛应用于田间害虫防治。自70年代以来,大量研究从受体蛋白与Bt互作的角度解析了 Bt杀虫的生化与分子机制,但有关肠... 详细信息

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌。由于其独特的杀虫活性,已被广泛应用于田间害虫防治。自70年代以来,大量研究从受体蛋白与Bt互作的角度解析了 Bt杀虫的生化与分子机制,但有关肠道微生物在Bt杀虫过程中的调控作用尚不明确。本研究以鳞翅目害虫二化螟(Chilo suppressalis)和从其肠道中分离纯化的肠球菌(Enterococcus)为研究对象,探究了肠道微生物对二化螟Cry1Ca蛋白敏感性的调控作用,揭示了肠道细菌与Cry1Ca蛋白互作,协同提高Cry1Ca蛋白对二化螟的杀虫作用,为提高Bt等生防菌杀虫效率和发展二化螟新型绿色防控技术提供重要科学依据。现将本文研究结果总结如下:1)从二化螟幼虫肠道中分离纯化得到289株可培养的细菌,用细菌特异性引物扩增16S rRNA片段,由高通量测序分析基因序列后,将其与NCBI的细菌16S rRNA数据库进行比对,发现有179个分离株属于肠球菌属(Enterococcus sp.),其中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)28株、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)88株、铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)42 株、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)21 株。2)在二化螟幼虫人工饲料中加入终浓度为500 μg/mL的青霉素、链霉素、利福平、金霉素和庆大霉素,处理二化螟初孵幼虫7天,用来消除二化螟肠道中的大量肠道细菌。然后通过取食生测明确了 4种肠球菌对二化螟Cry1Ca蛋白敏感性的影响。结果表明:单独将Cry1Ca蛋白加入到人工饲料中饲喂肠道无菌的二化螟幼虫,幼虫死亡率不到10%,体重抑制率达到90%以上;但Cry1Ca蛋白与肠球菌共同处理肠道无菌的二化螟幼虫时,发现魁北克肠球菌对Cry1Ca蛋白的杀虫作用不存在显著影响,但是铅黄肠球菌、粪肠球菌和蒙氏肠球菌分别显著提高幼虫死亡率60%、60%和30%。说明这三种肠球菌可以显著提高二化螟对Cry1Ca蛋白的敏感性。3)采用16S rRNA扩增子测序分析二化螟四龄幼虫经LC50剂量的Cry1Ca蛋白分别处理12 h和24 h后,幼虫血淋巴中微生物菌群的丰富度和多样性。根据序列相似性≥97%筛选得到3638个操作分类单元(operationaltaxonomic units,OTUs)。然后对测序的有效数据分别进行α多样性和β多样性分析。α多样性分析结果表明,Cry1Ca蛋白处理后二化螟血淋巴中微生物菌群的物种丰富度发生了显著变化。热图(Heatmap)与主成分分析(Principal Co-ordinates analysis Analysis,PCoA)结果表明,Cry1Ca 蛋白处理后二化螟血淋巴中微生物菌群的物种多样性也存在显著差异;线性判别分析(Linear discriminant analysis Effect Size Analysis,LEfSe)进一步明确了 Cry1Ca 蛋白处理 24 h 后,处理组幼虫血淋巴中肠球菌属的丰度显著高于对照组。这也表明,二化螟肠道中的肠球菌在Cry1Ca蛋白作用下,可从幼虫肠道转移到幼虫血腔中。4)在无菌条件下收集二化螟幼虫的血淋巴,过滤除菌后,在无菌的血淋巴液中接种肠球菌,以不接种肠球菌的血淋巴为空白对照,以肠球菌接种在LB液体培养基的处理为阴性对照。利用酶标仪测定不同处理中孵育不同时间的血淋巴混合液的OD600值。结果表明,肠球菌可以在二化螟血淋巴中增殖。将高浓度的肠球菌注射进入无菌幼虫血腔中,观察幼虫7天内的存活情况。幼虫的生存曲线结果表明,分别注射高浓度铅黄肠球菌、粪肠球菌和蒙氏肠球菌处理组的存活率分别显著下降了 40%、80%和80%,可见幼虫血腔中高浓度的肠球菌能导致幼虫死亡;并且注射24 h后幼虫表现出明显的黑化现象。5)采用饲喂抗生素的方法人工去除幼虫肠道细菌后,用肠球菌和Cry1Ca蛋白共同处理幼虫,7 天后收集处理幼虫血淋巴。采用 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)-mediateddUTP Nick-End Labeling(TUNEL)染色和 4’,6’-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染色分别标记血淋巴中凋亡的血细胞和全部血细胞,利用蔡司激光共聚焦显微镜采集荧光信息并在软件Image J 1.53K中对凋亡细胞和全部细胞分别进行计数,然后对不同处理中凋亡血细胞比例(凋亡血细胞与总血细胞的比值)进行差异显著性比较。结果表明,铅黄肠球菌、粪肠球菌和蒙氏肠球菌与Cry1Ca蛋白共同作用的处理组幼虫血淋巴中凋亡血细胞的比例分别显著提高了 6%、4%和23%。这说明,肠球菌与Cry1Ca蛋白协同作用,加速了幼虫血细胞

关键词：苏云金芽孢杆菌二化螟肠道微生物杀虫活性协同增效作用

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常德市水稻二化螟发生特点及防控对策

中国植保导刊 2023年第5期43卷 51-55页

作者：江曲詹红玉邓金奇湖南省常德市植保植检站湖南常德415000 湖南省临澧县植保植检站湖南临澧415200 湖南省汉寿县植保植检站湖南汉寿415900

近年来,常德市水稻二化螟发生呈上升趋势,表现出越冬基数逐年增加,发生世代逐渐进入完全4代,2、3代为害上升,4代虫伤株率增加等特点。笔者从耕作栽培、气候因素、害虫抗药性、防治因素等方面分析主要原因,提出精准测报、开展农业防治、... 详细信息

近年来,常德市水稻二化螟发生呈上升趋势,表现出越冬基数逐年增加,发生世代逐渐进入完全4代,2、3代为害上升,4代虫伤株率增加等特点。笔者从耕作栽培、气候因素、害虫抗药性、防治因素等方面分析主要原因,提出精准测报、开展农业防治、生物防治、生态调控和物理诱控、科学用药等综合防控措施。

关键词：水稻二化螟发生特点防控对策

路明卫拌种处理对水稻生长和防治二化螟的效果

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中国稻米 2023年第1期29卷 121-125页

作者：徐春梅肖德顺章秀福陈松褚光刘元辉王丹英中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室杭州310006

水稻生产中,二化螟的抗药性问题日益突出,为害逐年加重。路明卫是一种防治水稻螟虫的悬浮种子处理剂,其主要成分是50%氯虫苯甲酰胺。为合理安全使用该农药,达到预期防治效果,开展了路明卫种子包衣处理对水稻发芽、出苗、秧苗素质以及二... 详细信息

水稻生产中,二化螟的抗药性问题日益突出,为害逐年加重。路明卫是一种防治水稻螟虫的悬浮种子处理剂,其主要成分是50%氯虫苯甲酰胺。为合理安全使用该农药,达到预期防治效果,开展了路明卫种子包衣处理对水稻发芽、出苗、秧苗素质以及二化螟防效的田间试验,同时进行了田间示范验证。结果表明,路明卫安全可靠,用其(10 mL/667 m^(2))处理干谷或芽谷,不影响种芽的伸长、种子发根和秧苗素质;且省工高效,用路明卫拌种后可减少水稻分蘖期间(播种至播后60 d)1次二化螟农药防治,不增加水稻枯鞘、枯心的发生,还表现出显著的抗卷叶螟优势。

关键词：路明卫水稻二化螟产量防治效果

叶面肥对水稻养分吸收、产量和二化螟危害的影响

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中国稻米 2023年第3期29卷 84-87页

作者：邬奇峰魏倩倩徐青山黄晶潘林朱练峰孔亚丽金千瑜张均华朱春权杭州市临安区农林技术推广中心杭州311300 中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室杭州310006 安徽大学合肥230000

施用合适的叶面肥有利于水稻生长和产量提高。本试验以5种不同类型的叶面肥为材料,分析比较了施用不同叶面肥对水稻养分吸收、产量及二化螟危害的影响。结果表明,5种叶面肥均能提高水稻体内氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe... 详细信息

施用合适的叶面肥有利于水稻生长和产量提高。本试验以5种不同类型的叶面肥为材料,分析比较了施用不同叶面肥对水稻养分吸收、产量及二化螟危害的影响。结果表明,5种叶面肥均能提高水稻体内氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锌(Zn)和钼(Mo)等营养元素的含量,显著提高水稻产量3.88%~7.47%,其中,瑞普生和丰瑞达牌叶面肥的增产效果较为显著,其次为彪榜、行万里和天需牌叶面肥。通过分析产量构成因子后发现,施用叶面肥增产的主要原因在于提高了每穗粒数。行万里牌叶面肥可以显著降低二化螟引起的水稻枯心丛率和枯心株率,其余叶面肥对降低水稻枯心丛率和枯心株率没有显著效果。施用不同叶面肥处理的经济效益表现为丰瑞达>瑞普生>彪榜>天需>行万里。在实际生产中可根据需要选择适宜的叶面肥品种。

关键词：叶面肥水稻养分产量二化螟

二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因RNA干扰技术体系的优化

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昆虫学报 2018年第8期61卷 914-922页

作者：孙娜杨琼韩阳春张茹王利华方继朝南京农业大学植物保护学院南京210095 江苏省农业科学院植物保护研究所南京210014

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER... 详细信息

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER基因的dsRNA导入果蝇S2细胞内;分别通过显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法将体外合成的二化螟saCER和snSMase基因的特异性双链RNA(dsRNA)导入二化螟3龄(注射法)和2龄(喂食法)幼虫体内,之后利用qPCR测定靶标基因的mRNA表达水平,比较不同方法对不同基因的RNA干扰效率。【结果】将果蝇S2细胞浸泡在浓度为15 ng/μL的含daCER dsRNA细胞培养液中培养72 h后,daCER基因的表达水平下降了约84%。dsRNA (5 000 ng/μL)注射二化螟3龄幼虫60 h后对saCER基因的干扰效率达到最高(41%),dsRNA (2 500 ng/μL)注射48 h后对snSMase基因的干扰效率最高(47%);给二化螟2龄幼虫喂食dsRNA(48μg/d)后,分别在第7天和第8天对saCER(32%)和snSMase(52%)基因达到最大干扰效率。对于aCER基因,果蝇S2细胞浸泡法与二化螟注射法和喂食法相比,干扰效率差异极其显著;使用相同方法,对saCER基因和snSMase基因的干扰效率无显著差异;对于二化螟的同一基因(saCER或者snSMase),注射法与荧光纳米粒子喂食法之间干扰效率也无显著性差异。【结论】碱性神经酰胺酶基因和中性鞘磷脂酶基因对导入dsRNA进行RNAi的方法较敏感,本研究建立并优化的显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法RNAi技术体系在鞘脂质代谢酶基因功能的基础研究中具有可行性。注射法和喂食法对二化螟幼虫aCER基因的干扰效率远低于浸泡法对果蝇S2细胞中这一基因的干扰效率,进一步证实二化螟血淋巴中的RNA酶对dsRNA的快速降解以及中肠围食膜的阻隔很大程度上削减了dsRNA进入二化螟细胞内发挥干扰作用。

关键词：二化螟碱性神经酰胺酶中性鞘磷脂酶 RNAi 显微注射法荧光纳米粒子介导喂食法浸泡法

二化螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的鉴定与表达模式分析

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应用昆虫学报 2018年第3期55卷 349-359页

作者：金燕璐张邦贤林华峰安徽农业大学植物保护学院合肥230036 滁州学院科技处滁州239000

【目的】鉴定二化螟Chilo suppressalis谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)基因,明确GST基因在幼虫各组织中的表达谱,并分析GST应对氯虫苯甲酰胺胁迫的表达模式。【方法】从二化螟转录组数据库中鉴定GST的c DNA序列,使... 详细信息

【目的】鉴定二化螟Chilo suppressalis谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)基因,明确GST基因在幼虫各组织中的表达谱,并分析GST应对氯虫苯甲酰胺胁迫的表达模式。【方法】从二化螟转录组数据库中鉴定GST的c DNA序列,使用实时荧光定量PCR技术分析GST在幼虫不同组织内的相对表达水平,并考察亚致死剂量氯虫苯甲酰胺处理幼虫之后GST表达水平的变化。【结果】从二化螟转录组中检索得到16个GST基因,分别被命名为Cs GSTd1-Cs GSTu1。这16个GST被划分为6个家族(Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Zeta和Theta)和一个"未分类"亚组(Unclassified subgroup)。Cs GSTd2、Cs GSTd3、Cs GSTe1、Cs GSTo3、Cs GSTt1主要表达于脂肪体,Cs GSTe3主要表达于马氏管。未检测到特异表达于中肠的GST基因。氯虫苯甲酰胺处理6 h后,Cs GSTo2显著上调,但Cs GSTd2、Cs GSTd3、Cs GSTe3、Cs GSTo1和Cs GSTt1显著下调。药剂处理12 h后,Cs GSTd1、Cs GSTd2、Cs GSTd3、Cs GSTe1、Cs GSTe2、Cs GSTe3、Cs GSTo2、Cs GSTo3、Cs GSTo4和Cs GSTt1显著上调,而Cs GSTu1显著下调。【结论】Cs GSTd1、Cs GSTd2、Cs GSTd3、Cs GSTe1、Cs GSTe2、Cs GSTe3、Cs GSTo2、Cs GSTo3、Cs GSTo4和Cs GSTt1可能参与了对氯虫苯甲酰胺的解毒代谢。

关键词：二化螟谷胱甘肽-S-转移酶序列分析表达模式

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浙南连作晚稻上二化螟的药剂防治效果

中国植保导刊 2024年第1期44卷 90-92,96页

作者：陈红沈宣才方辉潘伟叶徐豪浙江省临海市农业技术推广中心浙江临海317000 浙江省台州市农资有限公司浙江台州318000 浙江省临海市古城街道农业公共服务中心浙江临海317000

二化螟对浙南水稻的为害逐年加重,为提高当地施药防治效果,选择不同类型的杀虫剂进行配施或单施,调查并比较不同处理对重发区连作晚稻二化螟的控制效果。结果表明,在分蘖初期施用2次25%喹硫磷乳油200 mL+80%杀虫单可溶粉剂100 g的效果较... 详细信息

二化螟对浙南水稻的为害逐年加重,为提高当地施药防治效果,选择不同类型的杀虫剂进行配施或单施,调查并比较不同处理对重发区连作晚稻二化螟的控制效果。结果表明,在分蘖初期施用2次25%喹硫磷乳油200 mL+80%杀虫单可溶粉剂100 g的效果较优,第2次药后30 d保苗效果在70%以上,为各处理中最高,对于高龄二化螟的虫口防效为82.76%,也明显高于其他处理。但调查中也发现,各药剂处理对低龄二化螟的控制作用不强,酰胺类、阿维菌素类杀虫剂对当地二化螟难达理想防效。

关键词：二化螟杀虫剂保苗效果控虫效果

5种杀虫剂对二化螟不同龄期幼虫的毒力和防效

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杂交水稻 2022年第3期37卷 25-28页

作者：戴长庚李鸿波魏琪胡阳贵州省农业科学院植物保护研究所贵州贵阳550006 中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室浙江杭州310006

利用人工饲料药膜法和盆栽试验,分别比较研究了氯虫苯甲酰胺、杀虫双、苏云金杆菌、球孢白僵菌及绿僵菌对水稻二化螟初孵、4龄幼虫的毒力和防效,以期为筛选有效控制二化螟的高效杀虫剂提供科学依据。结果表明:供试药剂对二化螟幼虫的毒... 详细信息

利用人工饲料药膜法和盆栽试验,分别比较研究了氯虫苯甲酰胺、杀虫双、苏云金杆菌、球孢白僵菌及绿僵菌对水稻二化螟初孵、4龄幼虫的毒力和防效,以期为筛选有效控制二化螟的高效杀虫剂提供科学依据。结果表明:供试药剂对二化螟幼虫的毒力均随龄期增大而降低,其中球孢白僵菌对不同龄期幼虫均保持相对较高的毒力,LC_(50)为4.06~16.99 mg/L,其次为氯虫苯甲酰胺,LC_(50)为77.17~166.19 mg/L;而苏云金杆菌和杀虫双对不同龄期幼虫的毒力水平差异很大,其对初孵幼虫的LC_(50)分别为156.25、333.56 mg/L,但对4龄幼虫的LC_(50)依次升至46204.78、31883.12 mg/L。盆栽试验结果与室内毒力结果基本一致,即5种杀虫剂对二化螟幼虫的防效随龄期增加而下降,其中球孢白僵菌对不同龄期幼虫的防效最高,为70.3%~97.1%,其次为氯虫苯甲酰胺,防效为48.6%~88.6%;而绿僵菌、苏云金杆菌和杀虫双对初孵幼虫的防效为65.7%~82.9%,但对4龄幼虫的防效显著降低,仅2.7%~24.3%。因此,建议于二化螟低龄幼虫期,选用球孢白僵菌或氯虫苯甲酰胺叶面喷雾进行防治。

关键词：水稻二化螟杀虫剂幼虫龄期毒力防效

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虫害诱导水稻挥发物对二化螟产卵的影响

虫害诱导水稻挥发物对二化螟产卵的影响

作者：刘畅华中农业大学

学位级别：硕士

水稻害虫二化螟Chilo suppressalis(Walker)广泛分布于中国、日本等多个亚欧大陆国家,严重威胁水稻生产。我国二化螟主要发生在长江流域及其以南的水稻产区,以幼虫钻蛀稻茎为害。长期以来,我国二化螟的防治以化学防治为主,如何绿色高效... 详细信息

水稻害虫二化螟Chilo suppressalis(Walker)广泛分布于中国、日本等多个亚欧大陆国家,严重威胁水稻生产。我国二化螟主要发生在长江流域及其以南的水稻产区,以幼虫钻蛀稻茎为害。长期以来,我国二化螟的防治以化学防治为主,如何绿色高效地遏制二化螟种群数量并减少其带来的水稻产量损失是水稻生产中的棘手问题。本研究在发现二化螟驱避剂2-庚醇和α-雪松烯对二化螟雌蛾产卵分别有抑制和促进作用的基础上,从昆虫生理发育相关基因表达以及肠道菌群等方面,探索两种挥发物对二化螟雌蛾生殖的潜在影响机制,为开发基于产卵调控的二化螟绿色防控技术提供参考。主要研究结果如下:1.通过实验室试验研究了不同浓度2-庚醇和α-雪松烯对二化螟雌虫产卵量的影响。结果显示,2-庚醇在0.1μg/μl和1μg/μl浓度下对二化螟雌蛾的产卵量均有抑制作用,且在0.1μg/μl浓度下对雌蛾的产卵量抑制效果最显著(P二化螟雌蛾的产卵量有显著的促进作用(P二化螟卵巢卵黄原蛋白Vg与保幼激素(JH)的早期响应基因Kr-h1的实时表达动态。结果显示,α-雪松烯暴露处理后的雌蛾卵巢中Kr-h1基因的表达水平显著高于正己烷对照组(P二化螟雌蛾生殖相关通路基因的显著上调,且基因验证实验也证实这一结果,而且结果还显示昆虫抗逆性、激素前体、解毒酶等途径的关键基因也显著上调表达;2-庚醇暴露处理12 h后二化螟雌蛾免疫刺激相关通路基因显著上调,特别在细菌引起的免疫通路上变化明显,解毒酶相关基因显著上调表达,而蛋白质泛素化关键基因却显著下调表达。4.基于转录组测序结果,我们进一步研究了2-庚醇暴露处理二化螟雌虫中肠微生物群落的变化动态。16S扩增子测序结果显示,2-庚醇暴露处理12 h时后,二化螟雌蛾中肠微生物群落丰度显著降低,其中红球菌属与泛菌属两种微生物的相对丰度也显著低于其他暴露处理,两种微生物是否参与调控二化螟产卵有待进一步深入研究。综上所述,α-雪松烯暴露处理引起二化螟雌蛾生殖相关通路的上调,并且显著提高生殖相关基因Vg和保幼激素通路相关基因Kr-h1表达量,可能是促进雌蛾产卵的潜在机制。而2-庚醇暴露处理初期引起雌蛾免疫刺激相关通路的上调,在后期造成蛋白泛素化功能相关基因下调表达,并且雌蛾体内免疫菌群丰度的降低,这可能是引起雌蛾产卵量降低的原因之一,但两种水稻挥发物对二化螟雌蛾产卵影响的分子机制有待进一步深入研究。

关键词：二化螟虫害诱导水稻挥发物产卵行为转录组 16s扩增子微生物群落