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乳酰-n-新四糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究

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食品与发酵工业 2023年第21期49卷 23-29页

作者：骆叶姣胡苗苗李梦丽张涛食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122

乳酰-n-新四糖(lacto-n-neotetraose,LnnT)是人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中的重要成分之一,已被美国和欧盟的食品药品监督管理局批准作为新资源食品配料添加到食品中。为实现乳酰-n-新四糖底盘菌株的构建和产物的高效合... 详细信息

乳酰-n-新四糖(lacto-n-neotetraose,LnnT)是人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中的重要成分之一,已被美国和欧盟的食品药品监督管理局批准作为新资源食品配料添加到食品中。为实现乳酰-n-新四糖底盘菌株的构建和产物的高效合成,构建了含有关键酶基因lgtA、nmlgtB、glmS和galE过表达的重组菌株。将重组菌在(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导下摇瓶发酵培养,利用不同拷贝数的质粒对模块化LnnT合成通路进行组合筛选,结果表明,最佳质粒组合为pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-nmlgtB,菌株SA1生产LnnT的产量达到1.168 g/L。进一步地,通过改变培养基种类、诱导温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度及诱导时刻来优化发酵条件,结果表明,重组菌株的最佳发酵培养基为DM培养基,诱导温度25℃,IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间8 h,优化后工程菌SA1摇瓶发酵LnnT的产量为2.50 g/L,比优化前提高了114%。通过3-L发酵罐发酵,LnnT的产量达到了14.25 g/L,是目前报道的最高产量。该研究为LnnT工业化生产提供了方法学思路,为微生物发酵制备人乳寡糖提供了重要的参考价值。

关键词：乳酰-n-新四糖生物合成基因敲除模块化工程发酵优化

乳酰-n-新四糖生产菌株的构建及发酵工艺研究

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乳酰-N-新四糖生产菌株的构建及发酵工艺研究

作者：骆叶姣江南大学

学位级别：硕士

乳酰-n-新四糖(Lacto-n-neotetraose,Lnn T)是一种中性非岩藻糖基化人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs),占人乳寡糖含量的6%左右。因其具有益生元、免疫调节、抑菌、抗病毒等多种生理功能而被广泛应用于婴幼儿配方奶粉、老年... 详细信息

乳酰-n-新四糖(Lacto-n-neotetraose,Lnn T)是一种中性非岩藻糖基化人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs),占人乳寡糖含量的6%左右。因其具有益生元、免疫调节、抑菌、抗病毒等多种生理功能而被广泛应用于婴幼儿配方奶粉、老年食品、功能性饮料及保健品等领域。目前,Lnn T已被美国FDA(*** and Drug Administration)和欧盟批准作为一般公认安全食品(GRAS)和新型食品(nF)添加到婴幼儿配方奶粉当中。中国大陆还未正式获得Lnn T的批准,然而,国内对Lnn T的重视程度与日俱增,其市场空间广阔,应用潜力巨大。传统的化学和酶法合成Lnn T存在反应过程繁琐、关键前体价格昂贵等问题,微生物细胞工厂制备Lnn T能够更好的满足工业化生产成本低、工艺简单、低碳环保等需求。国内微生物生产Lnn T的相关报道较少且产量偏低,利用整合型大肠杆菌BL21(DE3)生产Lnn T仍未见报道。本课题通过基因筛选、代谢途径重构、模块优化、弱化底物及关键前体分支途径、RBS优化限速酶、构建无抗菌株等基因操作手段,对底盘微生物大肠杆菌BL21(DE3)进行系统改造,实现了质粒型和整合型Lnn T生产菌株的构建。课题研究对Lnn T高效生物合成关键问题的解决以及其他HMOs及其他杂合糖的开发提供新的思路。主要研究内容和结果如下:(1)以菌株*** BL21(DE3)为宿主菌株,基于p CDFDuet-1和p ETDuet-1双质粒表达系统构建从头合成Lnn T的微生物细胞工厂。对UDP-Glc nAc模块关键酶基因(glm S,glm M和glm U)和UDP-半乳糖模块关键酶基因(pgi,pgm,gal U和gal E)进行基因筛选和质粒构建。UDP-Glc nAc模块中菌株B-R1(含有glm M)、B-R2(含有glm U)、BR3(含有glm S)Lnn T的滴度分别为0.354 g/L、0.214 g/L、0.456 g/L,其中含有glm S的菌株B-R3生产Lnn T的性能较好;UDP-半乳糖模块中B-C1(含有pgi)、B-C2(含有pgm)、B-C3(含有gal U)、B-C4(含有gal E)和B-C5(含有gal U-gal E)Lnn T的滴度分别为0.2836 g/L、0.2534 g/L、0.6198 g/L、0.742 g/L、0.374 g/L,其中含有gal E的菌株B-C4生产Lnn T的性能较好。(2)分析竞争途径,使用CRISPR-Cas9基因编辑系统删除了*** BL21(DE3)中的竞争靶基因lac Z和wec B,阻断底物乳糖降解并促进中间体UDP-Glc nAc的胞内供应,使碳通量最大程度地流向Lnn T的生物合成途径,研究摇瓶水平下重组菌生产Lnn T的发酵性能。分别获得重组菌株BL21(DE3)Δlac Z、BL21(DE3)Δwec B和BL21(DE3)Δlac ZΔwec B。上述三种缺陷菌获得Lnn T的产量分别为0.350、0.315和0.452g/L,与对照组菌株相比(0.276 g/L),产量分别增加了26%、14%和64%。(3)通过质粒表达系统对途径基因进行组装,构建不同拷贝数的表达载体以增加上游关键基因和下游糖基转移酶的表达水平,比较不同组合菌株的Lnn T生产性能。对最佳组合菌株进行培养基(M9、M9CA、MOPS和DM)和诱导条件(温度、浓度和时间)优化,并在3-L发酵罐中进行补料分批发酵。发酵结果显示SA1～SA12共12种菌株摇瓶发酵后Lnn T的产量分别为1.17 g/L、0.42 g/L、0.69 g/L、0.19 g/L、0.65 g/L和0.45 g/L、0.37 g/L、0.42 g/L、0.46 g/L、0.11 g/L、0.24 g/L和0.11 g/L。含有重组质粒p ET-glm S-gal E和p RSF-lgt A-nmlgt B的工程菌SA1获得了1.168 g/L的最高产量。组合菌株最佳培养条件为使用DM培养基,诱导温度为25°C,诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为8 h,3-L发酵罐中补料分批发酵最高产量为14.25 g/L。(4)通过RBS筛选并微调了限速酶β-1,4-半乳糖基转移酶的表达强度和翻译起始速率,研究摇瓶水平下含有不同RBS工程菌的Lnn T生产水平,将最佳筛选菌株在3-L发酵罐中进行补料分批发酵,使菌株具备工业化应用潜力。含有RBS(BBa＿B0064)的菌株效果最好,产生了3.34 g/L的Lnn T。3-L发酵罐中补料分批发酵最终产生了15.68g/L的Lnn T,是摇瓶培养的4.72倍。(5)重塑大肠杆菌BL21(

关键词：乳酰-n-新四糖核糖体结合位点组合优化基因编辑工程菌

来源于Histophilus somni β-1,4-半乳糖基转移酶的酶学性质与代谢工程法合成乳酰-n-新四糖

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来源于Histophilus somni β-1,4-半乳糖基转移酶的酶学性质与代...

作者：罗国聪江南大学

学位级别：硕士

乳酰-n-新四糖是人乳寡糖中重要组成成分,可作为益生元,具有调节肠道菌群等生理功能。已被批准作为食品配料加入到配方奶粉当中。β-1,4-半乳糖基转移酶作为合成乳酰-n-新四糖的关键酶,目前鉴定报道较少,且和大多数糖基转移酶一样在大... 详细信息

乳酰-n-新四糖是人乳寡糖中重要组成成分,可作为益生元,具有调节肠道菌群等生理功能。已被批准作为食品配料加入到配方奶粉当中。β-1,4-半乳糖基转移酶作为合成乳酰-n-新四糖的关键酶,目前鉴定报道较少,且和大多数糖基转移酶一样在大肠杆菌异源表达过程中容易形成包涵体。本课题筛选得到一种来源Histophilus somni的可在大肠杆菌中高水平可溶性表达的新型β-1,4-半乳糖基转移酶(Hs-β-1,4-Gal T),并研究了该酶的酶学性质,利用该酶构建了乳酰-n-新四糖的合成途径,和蛋白结晶初步研究。本课题的总结如下:(1)Hs-β-1,4-Gal T的最适反应条件表明,转糖苷酶活的最适p H和最适温度分别为p H 6.0和30℃,且该酶具有严格的Mg依赖性。在弱酸性条件下可以保持90%的残余酶活,维持较高的催化能力。nano DSC结果表明Hs-β-1,4-Gal T解折叠温度(T)为44.49°C。体外酶法合成乳酰-n-新四糖的研究表明,该酶以1.5 m M乳酰-n-三糖II(LnT II)、1.5 m M尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)为底物,可生产合成0.43 m M乳酰-n-新四糖(Lnn T),平衡转化率为33%。(2)基于Hs-β-1,4-gal T基因,在*** BL21(DE3)衍生菌株E42-ΔWnL中构建了具有合成Lnn T能力的菌株。首先,将Hs-β-1,4-Gal T编码基因构建到载体p ACYCDuet-1中,获得重组质粒p ACYC-Hs-gal T;随后,结合重组质粒p RSFDuet-glm MUS和p ETDuet-lgt A,在*** BL21(DE3)中过表达合成途径的6个关键酶Glm S、Glm M、Glm U、Gal T、nm-Lgt A和Hs-β-1,4-gal T;之后,重组菌株摇瓶发酵,以甘油为碳源,乳糖和半乳糖为底物,摇瓶发酵培养96 h后,Lnn T的产量达到了0.66 g/L;最后,敲除编码转录抑制因子的gal R和gal S基因,宿主菌株E43-Δgal SΔgal R经过摇瓶发酵培养96 h,Lnn T的产量达到了0.72 g/L。(3)通过ni亲和层析及凝胶过滤层析柱获得了高纯度目标蛋白Hs-β-1,4-Gal T。凝胶过滤层析结果表明,重组酶在缓冲液中的聚集状态均一。SDS-PAGE结果表明重组酶的纯度在98%以上,满足结晶的要求。使用坐滴法进行蛋白结晶初筛,18℃培养两周长出晶体,后经悬滴法优化后,最终获得一套最高分辨率约5(?)的衍射数据。

关键词：乳酰-n-新四糖 β-1,4-半乳糖基转移酶代谢工程晶体初步研究

婴幼儿配方食品中2’-岩藻糖乳糖和乳酰-n-新四糖的测定

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食品工业 2024年第11期45卷 325-329页

作者：李雅玫杨中黄刚刘俊沈晓芳李立吴凤琪深圳海关食品检验检疫技术中心深圳518000 新疆维吾尔自治区分析测试研究院乌鲁木齐830011 惠州海关综合技术中心惠州516006 成都海关技术中心成都610041 江南大学无锡214122 中国检验检疫科学研究院北京100176

建立高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品中2’-岩藻糖乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)和乳酰-n-新四糖(lacto-n-neotetraose,Lnnt)的分析方法。样品经70℃的水提取,2-邻氨基苯甲酰胺(2-AB)衍生,得到稳定的OS-2AB衍生物,用乙腈稀释衍生... 详细信息

建立高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品中2’-岩藻糖乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)和乳酰-n-新四糖(lacto-n-neotetraose,Lnnt)的分析方法。样品经70℃的水提取,2-邻氨基苯甲酰胺(2-AB)衍生,得到稳定的OS-2AB衍生物,用乙腈稀释衍生后的提取液,采用高效液相色谱-荧光检测器检测,外标法定量。结果表明,在10.0~200μg/L浓度范围内,2’-FL和Lnnt线性关系良好,相关系数均≥0.999。2’-FL和Lnnt的检出限均为12.0 mg/100 g,定量限均为36.0 mg/100 g。考察空白奶粉样品添加3个浓度水平的回收率结果,回收率在90%~105%范围内,相对标准偏差为1.29%~3.77%。该方法灵敏度高、选择性好、准确可靠、操作简单,可用于婴幼儿配方食品中2’-FL和Lnnt含量的同时检测。

关键词： 2’-岩藻糖乳糖乳酰-n-新四糖高效液相色谱法婴幼儿配方食品

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乳酰-n-新四糖代谢途径设计与调控研究

乳酰-N-新四糖代谢途径设计与调控研究

作者：张蔚江南大学

学位级别：硕士

乳酰-n-新四糖（Lacto-n-neotetraose,LnnT）是母乳中含量较高的母乳寡糖之一,可以作为食品添加剂加入到婴儿配方奶粉中,具有增强人体免疫力、降低疾病侵染几率、提高肠道功能等作用,应用前景良好。微生物发酵法是合成LnnT的常用方法之... 详细信息

乳酰-n-新四糖（Lacto-n-neotetraose,LnnT）是母乳中含量较高的母乳寡糖之一,可以作为食品添加剂加入到婴儿配方奶粉中,具有增强人体免疫力、降低疾病侵染几率、提高肠道功能等作用,应用前景良好。微生物发酵法是合成LnnT的常用方法之一,但其存在着底物转化率低、代谢途径复杂不利于产物合成等问题。因此,本研究利用重组大肠杆菌（Escherichia coli）对发酵合成LnnT的代谢途径和关键酶的表达进行调控,从而提高LnnT的合成效率。首先,选择野生菌株*** K12 MG1655作为出发菌株,构建LnnT的从头合成途径。将来源于脑膜炎奈瑟菌（nesseria meningitides）的编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶的lgtA基因和编码β-1,4-半乳糖基转移酶的lgtB基因克隆至表达载体pCDFDuet-1上,得到重组质粒pCDFDuet-lgtAB。然后,将重组质粒转化到原始菌株中进行表达,验证异源基因表达成功,通过摇瓶发酵验证,LnnT的初始产量为0.04 g/L,表明LnnT的从头合成途径构建成功。乳糖是合成LnnT的重要底物,为了提高底物乳糖的转化率,将分解乳糖的lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）敲除,并过表达控制乳糖进出细胞的lacY基因（编码β-半乳糖苷通透酶）,得到的重组菌株M0-PAB的LnnT产量为0.41 g/L,LnnT对乳糖的得率从0.01 mol/mol提高至0.09 mol/mol。此外,乳酰-n-三糖（Lacto-n-triose II,LnTII）是合成LnnT的重要中间产物,代谢途径中关键限速酶的表达量的变化,会影响LnTII的积累量,从而影响产物LnnT的产量。通过CRISPR-Cas9和CRISPRi基因编辑技术确定代谢途径中的关键限速酶,并对编码关键限速酶的基因pgi、glmS、glmM、glmU、manA、murA、wecB、nagB的表达进行组合优化,得到了LnTII积累量较高的菌株,利用改造后的菌株发酵合成LnnT,产量最高达到了1.04 g/L。最后,对前体UDP-半乳糖（UDP-glucose,UDP-Gal）代谢途径中编码关键酶的基因pgm、gal E、ugd的表达进行调控,得到产量最高的菌株M29AB,LnnT的产量达到1.2g/L,比对照菌株M0-PAB的产量提高了93%,LnnT对乳糖的产率达到0.28 mol/mol。并对发酵条件进行优化,得到了最优发酵条件:底物乳糖浓度5 g/L,发酵温度30℃,发酵时间60 h。

关键词：乳酰-n-新四糖乳酰-n-三糖母乳寡糖 CRISPR-Cas9 CRISPRi

基于乳酰-n-三糖Ⅱ强化的中性母乳寡糖高效生物合成研究

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基于乳酰-N-三糖Ⅱ强化的中性母乳寡糖高效生物合成研究

作者：张盼江南大学

学位级别：硕士

母乳寡糖(HMOs)在婴幼儿的成长过程中发挥着重要生理作用,其中的三种HMOs乳酰-n-新四糖(Lnn T)、乳酰-n-四糖(LnT)和乳酰-n-岩藻糖基五糖Ⅰ(LnFPⅠ)因在母乳中含量较高而受到广泛关注,不断有研究证实它们作为母乳中生物活性成分的生理价... 详细信息

母乳寡糖(HMOs)在婴幼儿的成长过程中发挥着重要生理作用,其中的三种HMOs乳酰-n-新四糖(Lnn T)、乳酰-n-四糖(LnT)和乳酰-n-岩藻糖基五糖Ⅰ(LnFPⅠ)因在母乳中含量较高而受到广泛关注,不断有研究证实它们作为母乳中生物活性成分的生理价值,上述三种HMOs作为新食品原料已被批准加入至部分食品中,国内外市场需求仍在不断扩大,如何满足HMOs的市场需求成为焦点。目前,获得上述三种HMOs的主要方式为利用微生物合成生产,*** BL21(DE3)在表型和基因型水平有优良特征,被广泛用于制造食品和药物成分,其衍生菌株作为获准的Lnn T和LnT生产菌株,在代谢、毒理学和遗传毒性等方面的研究已证明其作为生产菌株的安全性。本文通过改造大肠杆菌*** BL21(DE3)菌株,构建了遗传稳定的LnTri II生产菌株,以此为基础分别构建得到了能高效生产Lnn T、LnT和LnFPⅠ的微生物合成菌株,主要研究成果如下:(1)构建遗传稳定的乳酰-n-三糖II(LnTri II)生产菌株,用于Lnn T、LnT和LnFP I的生物合成。通过敲除基因lac Z删除乳糖的细胞内降解途径,使用细菌染色体目的基因多拷贝方法将重组基因表达盒Ptac-lgt A转座插入至*** BL21(DE3)染色体上的插入序列IS186中异源表达β1,3-n-乙酰葡萄糖胺转移酶Lgt A,由内源产生的尿苷二磷酸-n-乙酰葡萄糖胺(UDP-Glc nAc)和外源添加的乳糖构建了LnTri II的从头合成途径,获得了6种工程大肠杆菌,最高的LnTri II产量为6.83 g/L。(2)将基因gal E整合至*** BL21(DE3)基因组上以生成前体尿苷二磷酸-半乳糖(UDP-Gal);使用在*** BL21(DE3)的IS186基因座上插入了不同拷贝lgt A的6种宿主菌株,搭配使用不同拷贝数的Duet-1系列质粒载体过表达异源β1,4半乳糖基转移酶基因(Aa-β1,4-Gal T)进行组合优化。通过Lgt A和Aa-β1,4-Gal T这两个关键酶的表达,实现了Lnn T在工程大肠杆菌中的生产。染色体基因座上插入三拷贝lgt A且含有质粒p AC-Aa的菌株EA21是优化组合中生物合成Lnn T的最佳菌株,Lnn T效价为0.88g/L。通过删除UDP-Glc nAc合成途径中编码葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶的基因nag B和编码UDP-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因wec B得到菌株EA37,其Lnn T效价为0.98 g/L,较对照菌株EA21提升了11.6%。(3)在能稳定生产LnTri II菌株的基础上将基因gal E整合至基因组上并通过转入质粒p CD-wbg O引入源自*** O55:H7的β1,3-半乳糖基转移酶Wbg O,构建了LnT的从头合成途径。菌株EB05在摇瓶发酵培养中LnT的产量达4.97 g/L;通过阻断UDPGlc nAc和UDP-Gal的竞争途径成功将LnT的产量提高至6.07 g/L。(4)在高效生产LnT菌株的基础上引入鸟苷二磷酸-岩藻糖(GDP-Fuc)合成途径和α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-FT)成功构建LnFP I的合成途径。GDP-Fuc的从头开始和补救途径被分别引入到底盘菌株后比较发现GDP-Fuc的从头合成途径对合成LnFP I更有利。筛选比较了7种不同来源α1,2-FT合成LnFP I的效果,发现源自*** O128的Wbs J的产量提升至2.53 g/L,且在LnFP I生物合成时没有副产物2’-FL产生。

关键词：乳酰-n-三糖II 乳酰-n-新四糖乳酰-n-四糖乳酰-n-岩藻糖基五糖Ⅰ