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中国组织工程研究 2024年

作者：林志光饶琪梁珊珊王若雨于炜婷大连大学附属中山医院肿瘤中心大连大学中山临床学院大连市海洋多糖生物材料转化医学重点实验室

背景：基质胶是当前培养肿瘤类器官的主要材料，但单纯基质胶不足以在体外模拟肿瘤生长的力学环境；在基质胶基础上引入海藻酸盐材料可提升水凝胶刚度，但水凝胶力学性能在长期培养中难以维持稳定。目的：在乳腺癌类器官培养体系中引入... 详细信息

背景：基质胶是当前培养肿瘤类器官的主要材料，但单纯基质胶不足以在体外模拟肿瘤生长的力学环境；在基质胶基础上引入海藻酸盐材料可提升水凝胶刚度，但水凝胶力学性能在长期培养中难以维持稳定。目的：在乳腺癌类器官培养体系中引入少量钙离子，观察其对基质胶-海藻酸钠水凝胶长期力学性能的维持作用。方法：(1)在恒定质量浓度(5 mg/mL)的基质胶中引入不同质量浓度(0,2.5,5 mg/mL)的海藻酸钠，分别制备低、中、高刚度水凝胶，使用流变仪定期测量水凝胶的力学性能。(2)将人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231重悬于不同刚度的水凝胶预凝胶中，成胶后加入含(或不含)钙离子的乳腺癌类器官因子培养基，进行乳腺癌类器官培养，在设定的时间点，使用流变仪定期测量引入钙离子对水凝胶力学性能的影响，光学显微镜下观察乳腺癌类器官形态变化，统计第13天乳腺癌类器官成球率。乳腺癌类器官培养7 d后，加入不同浓度(0.1,1,10,100 nmol/L)的化疗药物多西他赛干预6 d，检测细胞活力，计算多西他赛的半抑制浓度IC50。结果与结论：(1)海藻酸钠的加入有效提高了水凝胶的力学强度。(2)随着乳腺癌类器官培养时间的延长，水凝胶的力学强度均降低，培养第13天，中、高刚度水凝胶在含钙离子培养环境中的力学性能均显著高于在不含钙离子培养环境中的力学性能(P 0.05)。在长期培养中(13 d)，中、高刚度水凝胶组乳腺癌类器官随水凝胶力学性能的下降由圆形转化为梭形，而引入钙离子后两组乳腺癌类器官形态不随培养时间延长而改变。在培养环境中引入钙离子对低刚度水凝胶组乳腺癌类器官成球率无影响，但可提升中、高刚度水凝胶组乳腺癌类器官成球率。(3)在不含钙离子的培养环境中，随着多西他赛浓度的升高，乳腺癌类器官的细胞活力均降低，3组水凝胶组间的IC50无明显差异(P> 0.05)；在含钙离子的培养环境中，随着多西他赛浓度的升高，乳腺癌类器官的细胞活力均降低，中、高刚度水凝胶组乳腺癌类器官的细胞活力强于低刚度水凝胶组，IC50高于低刚度水凝胶组(P 乳腺癌类器官培养体系中引入钙离子可维持基质胶-海藻酸钠水凝胶的力学性能。

关键词：肿瘤类器官乳腺癌类器官海藻酸钠基质胶复合水凝胶基质刚度药物反应

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乳腺癌类器官放射生物学模型初步研究

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中华放射肿瘤学杂志 2022年第6期31卷 556-561页

作者：栗丽韩中斌陈宏甡梁珊珊王若雨辽宁省乳腺及消化肿瘤分子标志物高通量筛选及靶向药物转化重点实验室大连116001 大连大学附属中山医院肿瘤科大连116001 大连大学附属中山医院乳腺甲状腺外科大连116001

目的构建乳腺癌类器官培养体系并对其进行组织学表征与初步放射生物学特征研究。方法体外培养不同分子分型乳腺癌细胞系和肿瘤组织细胞形成乳腺癌类器官,对其进行组织结构表征并利用Ki-67、ER、PR、Her2指标进行免疫组化染色;对三阴性... 详细信息

目的构建乳腺癌类器官培养体系并对其进行组织学表征与初步放射生物学特征研究。方法体外培养不同分子分型乳腺癌细胞系和肿瘤组织细胞形成乳腺癌类器官,对其进行组织结构表征并利用Ki-67、ER、PR、Her2指标进行免疫组化染色;对三阴性乳腺癌患者组织及乳腺癌细胞系形成的类器官进行4、8Gy照射处理,观测照射后0、24、48、96h的乳腺癌类器官个数以及直径变化来评估放射对类器官的杀伤情况。结果乳腺癌细胞系和患者来源组织在6d左右形成类器官结构;HE染色显示微结构,标志物表达具有空间异质性,肿瘤来源类器官与原组织的标志物表达具有相似性;照射处理MCF-7乳腺癌类器官后,生长停滞,部分形成的类器官崩解消失,48~96h,逐渐恢复增殖趋势;MDA-MB-231乳腺癌类器官呈现辐射耐受和生长停滞,但结构没有明显改变,96h仍未观察到恢复趋势;选取的三阴性患者组织来源的类器官也呈现辐射耐受,照射后类器官仍持续生长且结构没有明显改变,但生长趋势明显小于未照射组。结论不同来源与不同分子分型的乳腺癌细胞经体外培养形成的乳腺癌类器官具有微结构与异质性,可以反映来源组织标志物表达情况并展现不同的放射抵抗能力,三阴性乳腺癌来源的类器官更加耐照射。

关键词：乳腺癌类器官患者来源类器官模型放射抵抗肿瘤异型性

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乳腺癌类器官的建立及其在HER2 CAR-T细胞功能验证中的应用

乳腺癌类器官的建立及其在HER2 CAR-T细胞功能验证中的应用

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作者：张静重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:乳腺癌(Breast cancer,BC)是全球女性最高发病率的恶性肿瘤,全球女性乳腺癌发病率正在逐年升高,是全世界第一大肿瘤,女性健康正经受着重大威胁。目前临床上,根据乳腺癌典型分子受体:雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(... 详细信息

背景:乳腺癌(Breast cancer,BC)是全球女性最高发病率的恶性肿瘤,全球女性乳腺癌发病率正在逐年升高,是全世界第一大肿瘤,女性健康正经受着重大威胁。目前临床上,根据乳腺癌典型分子受体:雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达而制定患者的治疗方案,也并不适用于所有的乳腺癌患者。HER2乳腺癌恶性程度较高,早期易复发和转移,总体预后较差。传统的肿瘤细胞培养以及人源性肿瘤异种移植模型(Patient-derivedxenografts,PDX)为乳腺癌的基础研究,提供了大量材料,然而,由于许多实验室实验技术的缺陷以及PDX培养周期长,难以满足乳腺癌深入研究的需要。因此,研究人员迫切需要建立一个能够真实、准确地模拟人类肿瘤特征的实验模型。肿瘤类器官是取用患者体内原发性肿瘤组织,在实验室培养出的微型肿瘤3D模型,与传统的肿瘤细胞系和PDX模型相比,类器官具有拟合度高、培养周期短、传代稳定等优点,近年来在肿瘤研究中得到了广泛应用,并取得了一定的进展。目前,世界各地的实验室已陆续培养出肝脏、胰腺、肺、肾、视网膜等具有显微结构的类器官组织。过继性免疫疗法(Adoptive cell therapy,ACT)是今年来引起广大科研工作者的新兴肿瘤免疫疗法。该疗法从肿瘤患者或者健康人志愿者(Healthy donor,HD)体内分离出肿瘤抗原特异性T细胞(Tumor-antigen specific T cell),在体外进行基因改造后扩增或者直接扩增后再回输回患者体内,其对于难治性及转移性肿瘤患者的治疗有着较好的疗效。ACT疗法分为肿瘤浸润淋巴细胞疗法(Tumor infiltration lymphocyte,TIL),T细胞受体基因修饰T细胞疗法(T cell receptor-engineered T cells,TCR-T),嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor,CAR-T)等。近些年,CAR-T细胞免疫疗法在恶性血液肿瘤,例:B系急性淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia)的治疗上取得了鼓舞人心的成功,这种显著的疗效不仅导致了B细胞恶性肿瘤治疗模式发生明显的转变,而且也有力地推动了CAR-T细胞疗法在实体肿瘤中的应用。目前乳腺癌类器官(Breast cancer organoid,BCO)研究在国内尚处于起步阶段,且国外也缺乏利用CAR-T细胞对类器官模型进行功能验证的相关研究,鉴于此,我们拟通过构建HER2乳腺癌类器官模型,并利用该模型来验证HER2 CAR-T细胞的特异性杀伤功能,并建立一套CAR-T细胞体外功能验证的通用方法学,为CAR-T细胞免疫疗法的临床转化奠定基础。目的:1.构建HER2乳腺癌类器官模型。2.制备HER2 CAR-T细胞,并利用HER2乳腺癌模型进行特异性杀伤功能检测。3.基于上述模型初步建立一套适用于CAR-T细胞体外功能验证的通用方法,为CAR-T细胞免疫疗法的临床转化奠定基础。方法:1.收集HER2乳腺癌患者的肿瘤组织,构建乳腺癌类器官模型,镜下观察类器官生长状况并进行细胞计数。2.将培养的乳腺癌类器官和其来源肿瘤组织经石蜡包埋、切片,并分别进行H&E和ER、PR、HER2的免疫组化染色。3.利用基因工程技术,将HER2-CAR序列克隆进慢病毒表达载体p WPXL,构建含有CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD137(4-1BB)和CD3ζ共刺激结构域的sc Fv的二代CAR质粒,并利用三质粒慢病毒转染系统,制备HER2 CAR慢病毒。4.,采用密度梯度离心法将收集的健康人志愿者静脉血分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并添加Dynabeads活化,培养过程中分别IL-15+IL-21或者IL-2培养T细胞。5.制备HER2 CAR-T细胞:将HER2 CAR慢病毒感染PBMC,5天后流式细胞术检测HER2 CAR阳性率,10天后对HER2 CAR-T细胞进行非特异性快速扩增。6.HER2 CAR-T细胞杀伤性功能检测:分别以HER2乳腺癌细胞系SK-BR-3和乳腺癌类器官作为靶细胞,采用RTCA系统实时监测细胞的存活信号、采用钙黄绿素染色法进行HER2 CAR-T细胞特异性杀伤功能检测。结果:1.成功构建乳腺癌类器官模型,并通过形态学、分子水平(ER、PR以及HER2)和基因表达水平证实该类器官模型高度保留了原代肿瘤组织的遗传基因特性,为后续HER2 CAR-T功能检测奠定基础。2.IL-15/21联合ploybrene处理经Dyna

关键词：乳腺癌 HER2 乳腺癌类器官 CAR-T细胞免疫疗法

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多糖基水凝胶用于乳腺癌类器官载体的可行性研究

多糖基水凝胶用于乳腺癌类器官载体的可行性研究

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作者：白璐延安大学

学位级别：硕士

背景:乳腺癌类器官是近年新兴的一种乳腺癌模型,在乳腺癌的发病机制研究、药敏检测和新药开发等方面均发挥着重要作用。现今乳腺癌类器官体外三维培养载体的选择并没有统一规定,这在很大程度上影响了乳腺癌类器官培养的成功率。Matrige... 详细信息

背景:乳腺癌类器官是近年新兴的一种乳腺癌模型,在乳腺癌的发病机制研究、药敏检测和新药开发等方面均发挥着重要作用。现今乳腺癌类器官体外三维培养载体的选择并没有统一规定,这在很大程度上影响了乳腺癌类器官培养的成功率。Matrigel基质胶是来源于小鼠低分化软骨肉瘤中的细胞外基质提取物,因其可促进肿瘤细胞的生长、分化,被大多数学者用作乳腺癌类器官体外三维培养的载体。但近年研究表明,Matrigel基质胶中的批次差异性、鼠肿瘤源性、蛋白成分复杂性以及难以调控的机械性能等特点,使其并不适用于乳腺癌类器官的体外培养。天然多糖基水凝胶是可吸水膨胀为三维网络样结构的高分子材料,因其具有成分透明、理化性质可控及含水量大等优势,弥补了Matrigel基质胶的不足,有望成为乳腺癌类器官体外三维培养的新载体。目前尚未有专门的天然多糖基水凝胶用于乳腺癌类器官体外三维培养。目的:1、研制出多糖基水凝胶载体,并对其性能进行表征;2、评估该多糖基水凝胶是否符合生物安全性标准;3、对天然多糖基水凝胶载体中培养的乳腺癌细胞团进行表征,并与Matrigel基质胶中培养的乳腺癌细胞团进行对比,评价该天然多糖基水凝胶载体作为乳腺癌类器官体外三维培养的可行性。方法:1、对天然材料壳聚糖和海藻酸钠进行改性,制备N-羧乙基壳聚糖（N-Carboxyethyl Chitosan,CEC）和氧化海藻酸钠（Oxidized Sodium Alginate,OSA）,通过CEC上的氨基与OSA上的醛基发生Schiff base反应而形成多糖基水凝胶;2、通过调节天然多糖基水凝胶中CEC的浓度,并从成胶时间、体外降解时间、含水量、扫描电子显微镜下微观形态、孔隙形态、孔隙率等方面综合考虑,找到最符合乳腺癌细胞团存活的天然多糖基水凝胶配比;3、通过体内实验和体外实验对多糖基水凝胶进行生物安全性检测;4、将乳腺癌细胞分别接种于天然多糖基水凝胶和Matrigel基质胶中,从细胞形态检测、死活检测、增殖检测、功能表达检测等方面,对天然多糖基水凝胶及Matrigel基质胶中的乳腺癌细胞团进行对比评价;5、采用SPSS 26.0软件和Origin Pro 9.0软件处理数据,计量资料采用均数±标准差表示,数据的组间计量运用独立样本t检验。所有实验重复做3次以上,有统计学意义为P＜0.05（***:P＜0.001;**:P＜0.01;*:P＜0.05）。结果:1、研制出的天然多糖基水凝胶经过调配在成胶时间、体外降解时间、含水量、孔隙形态及孔隙率方面均符合乳腺癌细胞的体外三维培养;2、研制出的天然多糖基水凝胶符合生物安全性标准;3、天然多糖基水凝胶中培养出的乳腺癌细胞团在细胞形态、存活率、增殖及功能表达方面,与Matrigel基质胶中培养的乳腺癌细胞团进行对比,结果显示:在细胞形态方面,多糖基水凝胶中的MCF-7细胞团直径明显小于Matrigel基质胶中MCF-7细胞团直径,但较小的细胞团直径却可以在培养的后期（大于7天时）保证细胞团中央细胞的存活,有利于细胞团的长期培养。而在MCF-7细胞团的死活、增殖和功能表达方面,两者均无明显差异。结论:1、由CEC和OSA组成的多糖基水凝胶具有理化性能可控及生物相容性好等优势;2、该天然多糖基水凝胶可以作为乳腺癌类器官体外三维培养的载体。

关键词：乳腺癌类器官乳腺癌细胞 Matrigel 水凝胶壳聚糖海藻酸钠三维培养

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乳腺癌类器官构建与临床转化应用

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中华实验外科杂志 2020年第12期37卷 2354-2357页

作者：余金张殿龙韩芳梁珊珊王若雨辽宁省乳腺及消化肿瘤分子标志物高通量筛选及靶向药物转换重点实验室大连大学附属中山医院肿瘤科 116001 大连大学附属中山医院乳腺外科 116001 大连大学附属中山医院影像科 116001

乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤,具有复杂的遗传与病理特征。早筛早诊、靶向药物与免疫治疗的应用使乳腺癌患者的生存率显著提高,但复发和转移仍然威胁着乳腺癌患者的生存,患者个体化治疗仍是临床诊疗难点。乳腺癌类器官... 详细信息

乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤,具有复杂的遗传与病理特征。早筛早诊、靶向药物与免疫治疗的应用使乳腺癌患者的生存率显著提高,但复发和转移仍然威胁着乳腺癌患者的生存,患者个体化治疗仍是临床诊疗难点。乳腺癌类器官运用三维培养技术模拟肿瘤微环境,在体外培养乳腺癌肿瘤细胞,形成与体内肿瘤类似的组织结构,具有操作简便、周期短和通量高等优势,逐渐被广泛应用于药物敏感性筛选、个体化用药和乳腺癌生物学研究等领域。本文将对乳腺癌类器官的发展过程、构建方法与应用作一综述,以期为相关领域的研究者和探索方向提供参考。

关键词：乳腺癌类器官三维培养药物筛选个体化治疗

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