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3个与奶牛乳房炎抗性相关基因的克隆及比较基因组学分析

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3个与奶牛乳房炎抗性相关基因的克隆及比较基因组学分析

作者：李宏滨中国农业科学院

学位级别：硕士

乳房炎是造成奶牛业损失最严重的疾病,尽管在许多国家都广泛地实施了乳房炎防制措施,但它仍然是世界奶牛业面临的最大威胁。研究表明,奶牛乳房炎抗性在种间和种内都存在显著的遗传差异,通过遗传选择提高乳房炎抗性可能是解决这一重大疾... 详细信息

乳房炎是造成奶牛业损失最严重的疾病,尽管在许多国家都广泛地实施了乳房炎防制措施,但它仍然是世界奶牛业面临的最大威胁。研究表明,奶牛乳房炎抗性在种间和种内都存在显著的遗传差异,通过遗传选择提高乳房炎抗性可能是解决这一重大疾病最好的长期策略。本研究对β-防御素、AHCY、MPIF-1等三个基因进行了克隆和比较基因组学分析,旨在通过对上述与奶牛乳房炎抗性相关基因的分析,进一步揭示乳房炎抗性的分子机理。本研究取得的主要结果如下:1、根据GenBank中注册的牛β-防御素BNBD5的cDNA序列设计引物,成功扩增出牛β-防御素BNBD5基因的编码序列,构建了克隆质粒。2、牛、人、小鼠β-防御素氨基酸序列趋于中度保守,相似性74.3,一致性20.0,都属于β-防御素超家族成员。牛β-防御素蛋白模拟结构由三个β-片层反向组成,六个半胱氨酸形成三对二硫键稳定了β-防御素分子的三级结构。通过3D结构分析,证明牛β-防御素也是一种在上皮细胞表面具有微生物菌落抗性的抗菌肽。3、牛、人、小鼠AHCY氨基酸序列高度保守,相似性99.5,一致性95.1。牛AHCY蛋白包含3个保守结构域,其3D模拟结构主要由两部分组成,每个部分都是由两边的α-螺旋包围多个β-片层组成。4、牛、人、小鼠MPIF-1氨基酸序列保守性较高,相似性37.8,一致性29.7。牛MPIF-1蛋白包含:二聚体界面(I型、P型)、四聚体界面、受体结合凹槽、糖胺多糖(GAG)及N-loop结合位点等多种结构,其3D模拟结构显示MPIF-1以单体形式存在,由一个α-螺旋和3个β-片层组成,除了具有多数细胞趋化因子都具有的4个半胱氨酸外,MPIF-1还有另外两个半胱氨酸形成的一个二硫键。通过计算模拟结构的电荷分布,发现其具有一个明显的正电荷口袋。

关键词：奶牛乳房炎抗性 β-防御素 AHCY MPIF-1

新疆褐牛乳房炎抗性的全基因组DNA甲基化调控及关键基因分析

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新疆褐牛乳房炎抗性的全基因组DNA甲基化调控及关键基因分析

作者：王丹新疆农业大学

学位级别：硕士

本研究以新疆褐牛为研究对象,通过群体遗传学分析,选择不同SCC水平的新疆褐牛,利用MeDIP-seq方法构建了新疆褐牛不同体细胞数全基因组甲基化模式,利用BSP法分析了TRAPPC9基因的DNA甲基化程度,从群体水平和表观遗传水平解析与乳房炎抗性... 详细信息

本研究以新疆褐牛为研究对象,通过群体遗传学分析,选择不同SCC水平的新疆褐牛,利用MeDIP-seq方法构建了新疆褐牛不同体细胞数全基因组甲基化模式,利用BSP法分析了TRAPPC9基因的DNA甲基化程度,从群体水平和表观遗传水平解析与乳房炎抗性密切相关基因的遗传变异机制,主要结果如下:（1）收集新疆褐牛繁育中心2014年至2017年DHI测定的5 739条记录,最小二乘方差分析表明年度、季节、胎次、品种对体细胞分均有极显著的影响（P＜0.01）,新疆褐牛的体细胞评分极显著低于中国荷斯坦牛。通过DMU软件对新疆褐牛的产奶性状遗传参数估计表明新疆褐牛体细胞评分的遗传力为0.13。（2）采用DNA甲基化免疫共沉淀测序技术对不同体细胞数水平新疆褐牛血液样品进行全基因组DNA甲基化的检测,发现两组分别有49 757 183、37 459 756个reads比对到参考基因组的唯一位置上,在基因间区的peaks最多,其次是内含子、外显子和启动子等。筛选到的新疆褐牛乳房炎抗性相关差异基因1 934个。（3）结合前期MeDIP-seq中的差异DMR分析了TRAPPC9基因与CD4基因差异DMR区域CpG岛富集情况,采用BSP法分析得知临床乳房炎牛TRAPPC9基因DMR区域CpG甲基化状态均较高;CD4基因DMR区域中,临床乳房炎牛CpG岛甲基化率显著低于健康牛的CpG位点甲基化水平。

关键词： DNA甲基化 MeDIP-seq 体细胞评分乳房炎抗性新疆褐牛

bLF基因部分序列的PCR-SSCP分析及其作为乳房炎抗性分子标记的可行性研究

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bLF基因部分序列的PCR-SSCP分析及其作为乳房炎抗性分子标记的可...

作者：周磊南京农业大学

学位级别：硕士

本研究的目的在于通过对牛乳铁蛋白(bLF)基因部分序列的PCR-SSCPs分析，发现牛乳铁蛋白基因序列的多态性，采用生物信息学方法对基因启动子序列潜在调控元件和蛋白结合因子进行分析，并对突变产生的影响进行预测。同时以CMR作为乳房炎... 详细信息

本研究的目的在于通过对牛乳铁蛋白(bLF)基因部分序列的PCR-SSCPs分析，发现牛乳铁蛋白基因序列的多态性，采用生物信息学方法对基因启动子序列潜在调控元件和蛋白结合因子进行分析，并对突变产生的影响进行预测。同时以CMR作为乳房炎的抗性指标，结合bLF基因的多态性和奶牛的生产性能数据，分析乳铁蛋白基因多态作为乳房炎抗性分子标记的可行性。 1 牛奶中DNA的分离通过将牛奶中提取白细胞技术和热裂解提取DNA技术相结合建立了从牛奶中提取DNA技术程序。结果显示，提取DNA原液的平均浓度为0.5μg／ml，OD／OD的平均比值为0.9，说明DNA提取过程中蛋白残余量过高，通过PCR分析发现，已达到PCR反应的模板要求，可以作为一种快速提取DNA的方法。 2 bLF基因部分序列的PCR—SSCP分析根据NCBI上已登录的bLF基因启动子和第4、15外显子序列设计六对引物，扩增出bLF基因5’侧翼区和第4、15外显子。采用SSCP方法获得序列在个体间的多态性，将得到的多态进行测序分析，并利用生物信息学方法对启动子区潜在调控元件和蛋白结合因子进行预测。结果发现：在bLF基因的启动子区存在着分布在两个多态序列中的4个突变位点，分别为．945位T-＞C，-928位G-＞A，-28位A-＞C，+33位C-＞G，其中-945处的突变未有报道，为新发现的突变位点;第4、15外显子也各存在一个突变位点分别为118位A-＞G和166位T-＞C，其中第15外显子的突变未引起氨基酸序列的改变，而第4外显子的突变导致氨基酸序列中Ile突变为Val，通过DNAStar对突变蛋白进行相关分析发现，蛋白的疏水性、等电点等特性均未改变;通过MatInspector软件对启动子序列进行分析，发现多个调控元件和蛋白因子结合位点，包括通用转录因子(SP1／GC元件、TATA盒、CAAT盒)，类固醇激素受体(雌激素受体、CRE受体、RAR受体)和炎症响应因子(NF-κ B、AP1、STAT3)，预测bLF基因的表达和调控是通过NF-κ B途径和核激素受体途径完成转录调节的。 3 bLF基因多态作为乳房炎抗性分子标记的可行性研究以CMR作为乳房炎抗性指标筛选出抗性组和易感组，研究bLF基因部分序列的多态在各组间基因型和基因频率分布的差异，筛选出合适的分子标记;同时结合奶牛的

关键词：牛乳铁蛋白 PCR-SSCP 多态乳房炎抗性

奶牛乳房炎抗性相关基因Znf313的电子克隆与序列分析

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中国农学通报 2007年第1期23卷 6-8页

作者：曹随忠李宏滨姚学萍赵兴绪杜立新中国农业科学院畜牧研究所甘肃农业大学动物医学院兰州730070 四川农业大学动物科技学院雅安625014 四川农业大学动物科技学院甘肃农业大学动物医学院

电子克隆是基因克隆的新策略。利用一个患乳房炎奶牛外周血白细胞中差异表达的EST序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入pGEM-T质粒载体,测序得到的序列已被G... 详细信息

电子克隆是基因克隆的新策略。利用一个患乳房炎奶牛外周血白细胞中差异表达的EST序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入pGEM-T质粒载体,测序得到的序列已被GenBank收录(DQ010409)。该基因被命名为牛锌指蛋白313(Znf313)基因,开放阅读框1～693bp,推测编码230个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为25.67kD,等电点6.90。

关键词：牛Znf313基因电子克隆生物信息学乳房炎抗性

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奶牛乳房炎抗性相关基因Znf 313的电子克隆与序列分析

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奶牛乳房炎抗性相关基因Znf 313的电子克隆与序列分析

新疆褐牛乳房炎抗性相关基因的表达及生物信息学分析

中国畜牧兽医学会2006学术年会

作者：曹随忠李宏滨姚学萍赵兴绪杜立新中国农业科学院畜牧研究所四川农业大学动物科技学院甘肃农业大学动物医学院

电子克隆是基因克隆的新策略。本研究利用一个患乳房炎的奶牛外周血白细胞中差异表达EAT序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入 pGEM-T质粒载体,测序得到的... 详细信息

电子克隆是基因克隆的新策略。本研究利用一个患乳房炎的奶牛外周血白细胞中差异表达EAT序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入 pGEM-T质粒载体,测序得到的序列已被GenBank收录(DQ010409)。该基因被命名为牛锌指蛋白313(Znf313)基因,开放阅读框1-693bp,推测编码230个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为25．67kD,等电点6．90。

关键词：牛Znf 313基因电子克隆生物信息学乳房炎抗性

来源： cnki会议评论

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中国畜牧兽医 2020年第1期47卷 90-97页

作者：姜徽刘攀李媛媛刘奎国黄锡霞刘江卫胥磊杜建文桑扎根杨雪梅赵番番王丹新疆农业大学动物科学学院乌鲁木齐830052 乌鲁木齐种牛场新疆褐牛繁育中心乌鲁木齐830049

文章旨在分析新疆褐牛乳房炎抗性相关基因的分子生物学功能,为分子标记辅助育种工作在新疆褐牛乳房炎抗性性状中的研究奠定理论基础。试验采用DAVID 6.8软件对课题组前期研究及相关文献报道的乳房炎抗性相关基因(共20个基因)进行功能GO... 详细信息

文章旨在分析新疆褐牛乳房炎抗性相关基因的分子生物学功能,为分子标记辅助育种工作在新疆褐牛乳房炎抗性性状中的研究奠定理论基础。试验采用DAVID 6.8软件对课题组前期研究及相关文献报道的乳房炎抗性相关基因(共20个基因)进行功能GO富集及KEGG信号通路分析。采用String 10.0数据库进行蛋白相互作用网络分析,结合生物信息学分析和相关文献的研究结果,挑选出JAK 2和STAT5A基因,通过使用实时荧光定量PCR技术检测JAK2、STAT5A基因在不同乳房健康程度的新疆褐牛血液中的相对表达量。GO富集分析得到,20个基因主要涉及细胞膜、免疫应答和调节防御反应等生物过程;KEGG富集分析发现,这些基因主要参与JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、ErbB信号通路等;PPI分析发现,20个基因中有8个基因之间存在直接或间接联系;实时荧光定量试验发现,JAK2、STAT5A基因在健康新疆褐牛血液的表达量极显著或显著高于患乳房炎新疆褐牛(P乳房健康程度的新疆褐牛与JAK2、STAT5A基因表达之间的内在联系。

关键词： JAK 2基因 STAT5A基因实时荧光定量PCR 乳房炎抗性新疆褐牛

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中国荷斯坦牛LYZ基因多态性及其与乳房炎的关联分析

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中国农业科学 2010年第23期43卷 4936-4941页

作者：陈仁金杨章平毛永江陈莹常玲玲吴海涛冀德君李云龙张亚琴扬州大学动物科学与技术学院

【目的】通过研究中国荷斯坦牛溶菌酶基因(lysozyme,LYZ)编码区多态性与乳房炎的关联性,寻找与乳房炎相关的分子标记,加快中国荷斯坦牛的抗病育种进程。【方法】利用PCR-SSCP技术对30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛LYZ基因进行多态性检... 详细信息

【目的】通过研究中国荷斯坦牛溶菌酶基因(lysozyme,LYZ)编码区多态性与乳房炎的关联性,寻找与乳房炎相关的分子标记,加快中国荷斯坦牛的抗病育种进程。【方法】利用PCR-SSCP技术对30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛LYZ基因进行多态性检测,利用最小二乘均数法对LYZ基因的多态位点与SCS和305d产奶量进行相关分析【结果】LYZ基因的外显子1上存在115(T>G)突变位点,突变使精氨酸变为亮氨酸;突变位点经PCR-SSCP法检测发现了3种基因型TT、TG和GG,频率分别为0.270、0.508和0.222,χ2检验表明中国荷斯坦牛在该位点偏离Hardy-Weinberg平衡;GG基因型个体的SCS最小二乘均值极显著低于TT基因型个体(PG)位点GG基因型,对中国荷斯坦牛的SCS和305d产奶量有较大的遗传效应,可作为分子标记应用于奶牛乳房炎抗性的筛选。

关键词：中国荷斯坦牛 LYZ基因 PCR-SSCP 多态性体细胞评分 305d产奶量乳房炎抗性

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黑龙江垦区荷斯坦牛群遗传改良的关键问题

黑龙江畜牧兽医 2009年第8期 83-84页

作者：刘胜军韩玉静苗树军黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江八一农垦大学科技处

近年来黑龙江垦区奶业呈高速发展态势,奶牛饲养业以及乳品加工已经成为垦区国民经济和农业的重要产业,奶业产业化程度大大提高,同时必须看到垦区奶业发展模式仍以奶牛数量增加为主,奶牛单产增加缓慢,效益下降,奶牛遗传改良工作滞后。

关键词：遗传改良牛群乳房炎抗性产犊间隔产犊指数奶牛场垦区