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茶皂素中乙醇脱氢酶活性组分的磁性分离及其特性研究

茶皂素中乙醇脱氢酶活性组分的磁性分离及其特性研究

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作者：袁弋婷南昌大学

学位级别：硕士

茶皂素(Tea saponins,TS)是一类从茶籽粕中提取出的副产物,主要以配基、糖体和有机酸组成其基本骨架,组成方式的多样性赋予了TS丰富的生物活性,如溶血性、抗炎活性、抑菌性、保肝护胃、影响酒精代谢等。近些年研究者开始集中于分离提取... 详细信息

茶皂素(Tea saponins,TS)是一类从茶籽粕中提取出的副产物,主要以配基、糖体和有机酸组成其基本骨架,组成方式的多样性赋予了TS丰富的生物活性,如溶血性、抗炎活性、抑菌性、保肝护胃、影响酒精代谢等。近些年研究者开始集中于分离提取茶皂素中的活性组分,因茶皂素组成的复杂性,活性单体的分离仍为研究的难点。磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNP)因其具有出色的磁响应性和高生物相容性等特点而被应用于各大领域。在食品相关的应用中,其常被用于酶的固定化、蛋白质纯化和食品分析。利用磁性载体固定化酶,不仅能提高酶的稳定性,更能提高酶的回收利用率。本研究通过将与酒精代谢直接相关的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)固定化于氨基功能化的磁性纳米粒子上,制备磁性固定化酶(magnetic immobilized ADH,MIADH),以MIADH作为工具靶向分离TS中的ADH活性组分(ADH-related active ingredients,AAI),同时构建体外解酒模型,对AAI影响酒精代谢的机理进行了探究,为磁性靶向分离技术和茶皂素的应用开发提供了理论基础和相关技术支持。主要研究结果如下:1.采用化学共沉淀法制备FeO磁性纳米粒子,通过单因素试验对其制备条件进行优化,建立了磁性纳米粒子的快速合成法并得到了尺寸合适、性能良好的复合磁性纳米粒子。结果显示,以FeSO与Fe Cl作为反应底物,反应温度60℃,反应时间30 min的条件下,制得的粒子粒径分布均匀,经透射电镜和扫描电镜表征结果综合验证,粒径大小控制在90～100 nm之间,饱和磁化强度为80.2 emu/g,具有超顺磁性,性能好;X射线衍射结果表明制备的FeO符合尖晶石型的四氧化三铁晶面。对获得的FeO进行表面Si O的包覆以及氨基功能化修饰,修饰后的粒子在水溶液中分散更为均匀,经电镜表征得知,粒子经修饰后仍呈圆球形,Si O外层的厚度约为16 nm,能谱仪扫描结果证明其表面成功接枝上氨基。由VSM曲线得知,由于修饰后硅层致密均匀,致使饱和磁化强度有所降低,但氨基功能化修饰前后粒子仍具有很好地磁响应性。2.利用复合磁性纳米粒子为载体对ADH进行磁性固定化研究,采用热重分析、红外光谱、磁响应曲线等对MIADH进行表征,并对其性质进行分析。结果显示,FT-IR图谱中出现固定化酶中所含有的-CO-NH-特征峰,得知ADH成功地固定化到了功能化磁性纳米粒子上,成功制得MIADH,且该结论通过热重分析结果得到证实,其饱和磁化值为21.6 emu/g,仍具良好的磁响应性。当ADH初始浓度为50μg/mL,固定化交联时间2.5 h,交联剂浓度5%时,能得到最优的MIADH,其酶活保留率为73.13%;ADH经固定化后显著提高了其储藏稳定性和复用稳定性,在4℃的储藏环境储藏至第4天,MIADH的相对酶活高于游离ADH的酶活10倍;MIADH使用至第15次仍具有超过70%的最初酶活,表现出较强的复用稳定性。磁性固定化后的MIADH酶活保留率较高,能够实现ADH的快速磁性分离和循环再利用。3.对TS进行纯化研究,并利用MIADH磁性分离了TS中的AAI。通过两级沉淀法对TS进行提纯,经紫外光谱和傅里叶红外光谱分析可得,提纯前后均在270 nm附近有紫外吸收峰,提纯后,1047.15cm和1049.36 cm处的红外透过率增强。利用MIADH磁性靶向分离出AAI,通过UPLC-QTOF-MS检测并对比数据库和参考文献可知,AAI中包含TS类化合物和非TS类化合物。根据离子碎片和参考文献推断,能够已知结构的活性物质包括以下三种:Oleiferasaponin A(CHO)、Camelliasaponin B(CHO)和Theasaponin A(CHO),该三者与乙醇吸收相关的生物活性已有报道,推测为经MIADH磁性分离的AAI中主要成分。4.构建体外解酒细胞模型,从生理生化指标和基因表达方面对AAI的护肝特性及解酒机理进行了探究。结果显示,在L02和Hep G2细胞中,AAI能减少乙醇所致的肝细胞毒性和凋亡,能降低AST和ALT的分泌,减少LDH和MDA的生成与泄露,提高GSH和SOD活性,同时能促进ADH和ALDH的酶活性,且均呈浓度依赖性。进一步通过RT-PCR结果可知,AAI对L02细胞和Hep G2细胞作用机理不同,其对相关基因的表达影响截然相反:于L02细胞而言,高剂量(10μg/mL)的AAI上调了ADH1B、ALDH2和CYP2E1的表达,炎症相关因子IL-6和TNF-α由低剂量(5μg/mL)AAI抑制,而于Hep G2细胞而言,ADH1B、ALDH2和CYP2E1的表达由低剂量的AAI促进,炎症相关因子则需高剂量进行干预。这

关键词：乙醇脱氢酶活性组分磁性固定化酶靶向提取成分鉴定解酒护肝特性

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茶皂素ADH组分改善酒精性胃损伤及其产品研发

茶皂素ADH组分改善酒精性胃损伤及其产品研发

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作者：杨保生南昌大学

学位级别：硕士

茶皂素作为山茶科山茶属植物中重要的生物活性成分,具有抑菌、消炎、抗氧化及解酒等多种作用,但由于其复杂的理化性质及结构,茶皂素活性成分的分离、结构组分的解析及功能特性值得被研究及开发应用。磁性固定化酶技术的生物特异性提取... 详细信息

茶皂素作为山茶科山茶属植物中重要的生物活性成分,具有抑菌、消炎、抗氧化及解酒等多种作用,但由于其复杂的理化性质及结构,茶皂素活性成分的分离、结构组分的解析及功能特性值得被研究及开发应用。磁性固定化酶技术的生物特异性提取方法能够从复杂天然产物中选择性提取某些活性组分,有着重复使用性和选择性。因此,本研究利用磁性纳米颗粒与乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）结合,从茶皂素中筛选出ADH组分（Tea saponin ADH ingredient,TSI）,并利用紫外、红外表征及液质联用检测探究其组分结构,利用Lineweaver-Burk和Dixon图研究TSI对ADH的抑制作用类型,再通过建立小鼠乙醇性胃损伤及大鼠乙醇性机体损伤模型,探究TSI的解酒功能,最后将茶皂素应用于颗粒剂的制备。具体内容及结果如下:（1）茶皂素ADH组分TSI的成分鉴定。利用ADH磁性固定化酶从茶皂素中筛选出活性组分TSI,对粗茶皂素和TSI进行紫外、红外光谱表征,两者的紫外图谱均在230 nm处出现强度一致的最高特征峰,两者的红外图谱出峰位置基本一致。利用液质联用技术对粗茶皂素和TSI进行检测,推测出三种已知结构的活性成分为:Theasaponin A4(C58H92O27)、Sasanquasaponins V(C59H96O25)、Floraassamsaponins V(C63H92O26)。（2）探究TSI对ADH的抑制作用类型。通过测定TSI对ADH活力的影响,得到当TSI浓度为6.0 mg/ml或TSI处理温度为40℃或体系反应时间为4.5min时,TSI对ADH的抑制能力基本达到最大值;TSI对ADH的半数抑制浓度IC50值为4.25 mg/ml。通过抑制作用类型分析、Lineweaver-Burk图和Dixon图确定了TSI对ADH的竞争性抑制常数Ki为0.5348,抑制类型为可逆性抑制中的竞争与非竞争的混合型抑制。（3）探究TSI对乙醇性胃损伤的作用及解酒机制。通过56度红星二锅头白酒（0.12ml/***）建立小鼠乙醇性胃损伤模型,发现低（50 mg/***）、中剂量（100 mg/***）的TSI能够减轻高剂量乙醇对胃黏膜前列腺素E2（PGE2）的破坏,抑制一氧化氮（NO）、白介素-8（IL-8）的产生,对胃组织具有保护作用。高剂量TSI相较于低、中剂量TSI对NO、IL-8的抑制效果不佳,推测是由于高剂量TSI对胃肠道有刺激损伤作用。通过56度红星二锅头白酒（6ml/***）建立大鼠乙醇性机体损伤模型,测定胃、肝脏及血清中有关肝肾、心脏、血糖血脂等指标,发现低、中、高剂量的TSI能够提高大鼠胃液量、胃液总酸度及胃酸总排量,降低胃蛋白酶活性、胃排空率,以达到护胃作用,表现为氨基己糖含量的上升;中、高剂量的TSI能够降低间接胆红素含量、总胆红素含量、ALT活力、白球比及MDA含量;高剂量的TSI能够提高SOD活力及球蛋白含量,达到增强肝脏抗氧化能力及减轻肝损伤的作用;低、中、高剂量的TSI能够抑制CK活力以保护心肌细胞;高剂量的TSI能够降低肾脏肌酐含量以减轻肾脏损伤;高剂量的TSI能够抑制高剂量乙醇导致的血糖升高,降低患2型糖尿病的风险。（4）茶皂素颗粒的制备。基于茶皂素解酒功能,以茶皂素、微晶纤维素、海藻糖、β-环糊精为原料制备茶皂素颗粒。以成型率、溶化率、堆密度、吸湿率为评价指标,通过干燥温度、乙醇浓度,及微晶纤维素、海藻糖添加比例四个单因素试验,及选取微晶纤维素、海藻糖添加比例及乙醇浓度进行三因素三水平正交试验,得出茶皂素颗粒的最佳制备配方及工艺条件为:茶皂素1%,微晶纤维素35%,海藻糖29%,β-环糊精5%,70%乙醇适量,70℃下干燥30 min,在此条件下制得的茶皂素颗粒外观性状、粒度合格率、含水量、干燥失重及溶化性均符合药典要求。此研究为茶皂素解酒功能在食品中的开发提供了参考。

关键词：茶皂素乙醇脱氢酶活性组分成分鉴定酒精性胃损伤颗粒剂

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