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希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的筛选及相关突变体基因的克隆

希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的筛选及相关突变体基因的克隆

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作者：赵典华中农业大学

学位级别：硕士

由希金斯刺盘孢{Colletotrichum higginsianum Sacc.)侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一类重要的世界性植物真菌病害,该菌分类地位属于真菌门,半知菌亚门,炭疽菌属。本实验室以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,已经成功建立农杆菌介导... 详细信息

由希金斯刺盘孢{Colletotrichum higginsianum Sacc.)侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一类重要的世界性植物真菌病害,该菌分类地位属于真菌门,半知菌亚门,炭疽菌属。本实验室以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,已经成功建立农杆菌介导转化体系并获得4500多个T-DNA随机插入突变体。通过培养性状和将突变体分生孢子液分别接种活体和离体拟南芥叶片,并以野生型为对照,比较其致病力差异;同时在塑料玻片上观察突变体分生孢子是否正常形成附着孢的筛选方法,筛选了638株突变体,得到1株致病力丧失转化子(Pch-1B30),2株致病力减弱转化子(Pch-1E240和Pch-1E590),1株生长缓慢转化子(Pch-1E409),1株产泡状菌丝转化子(Pch-1E808),1株产类似厚垣孢子转化子(Pch-1E43)和52株菌落白化转化子(Pch-1E101等)。Pch-1B30菌株不能使健康或针刺造成伤口的拟南芥离体或活体叶片发病,接种拟南芥叶片4d,只能观察到正常的附着胞及极少数出生菌丝,没有次生菌丝的形成。Southern杂交证实在Pch-1B30T-DNA标记为双拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1B30中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,其中一个T-DNA插入破坏的基因包含一个4612bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码991个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的DUF221(Domain of unknown function)具有高度同源相似性,相似度为98%,此蛋白功能未知。另一个T-DNA插入破坏的基因包含一个694bp的完整开放阅读框,包含一个内含子、两个外显子,编码208个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的外切体构件EXOSC1/CSL4(exosome component)具有高度同源相似性,相似度为86%,此蛋白是一种复杂的外切体亚基,其功能是正确处理去除错误RNA和基因正常水平的维护。基因表达试验表明DUF221基因在突变体Pch-1B30菌丝培养过程中不表达。Pch-1E240菌株株不能使健康拟南芥离体或活体叶片发病,但能使针刺的拟南芥叶片发病。显微观察发现该菌株接种健康拟南芥叶片4d,能正常形成附着胞、初生菌丝,但没有形成次生菌丝。Southern杂交证实在Pch-1E240T-DNA标记为单拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E240中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因其中一份包含一个2646bp的完整开放阅读框,包含五个内含子、六个外显子,编码669个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的乙酸辅酶A连接酶(Acetate-Coa Ligase)具有高度同源相似性,相似度为98%,乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物,是一个枢纽性的物质。Pch-1E590菌株接种健康的拟南芥叶片4d仍无发病症状,但能使刺伤或幼嫩的叶片正常发病,显微观察,能正常产生附着胞、初生菌丝、次生菌丝。Southern杂交验证该菌株T-DNA插入拷贝数为双拷贝。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E590中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,仅获得了一端基因序列,经过序列分析,表明该T-DNA未插入到含有完整开放阅读框的基因中。在筛选过程中还获得了1株生长缓慢转化子Pch-1E409。Southern杂交证实在T-DNA标记为单拷贝插入。采用反向PCR技术对Pch-1BE409中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因其中一份包含一个1947bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码576个氨基酸蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blastp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的胞裂蛋白Septin基因家族具有高度同源相似性,相似度为100%,此蛋白参与了细胞分裂、细胞极化、泡囊运输及胞膜重构等多个过程。

关键词：希金斯刺盘孢拟南芥突变体筛选反向PCR 乙酰辅酶a连接酶 Septin

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