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鱼腥藻PCC 7120乙酰辅酶a合成酶All0769的缺失降低异形胞频率

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水生生物学报 2023年第7期47卷 1025-1035页

作者：陈柏楠余胜超袁丽杨明坤葛峰大连海洋大学水产与生命学院大连116000 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072 中国科学院大学北京100049

研究鉴定了All0769为鱼腥藻PCC 7120中乙酰辅酶a合成酶,通过CRISPR/Cpf1系统敲除鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶a合成酶(由all0769编码),探究了乙酰辅酶a合成酶在异形胞分化中的调控机制。结果所示:All0769能在体外反应中催化乙酰辅酶A的... 详细信息

研究鉴定了All0769为鱼腥藻PCC 7120中乙酰辅酶a合成酶,通过CRISPR/Cpf1系统敲除鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶a合成酶(由all0769编码),探究了乙酰辅酶a合成酶在异形胞分化中的调控机制。结果所示:All0769能在体外反应中催化乙酰辅酶A的生成。在供氮环境下,敲除all0769会影响藻细胞生长速率。而无论环境中是否存在化合氮,Δall0769突变株的乙酰辅酶A和α-酮戊二酸含量均显著减少。在供氮环境下,Δall0769突变株中检测到(26.17±1.55)nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(43.04±1.09)nmol/mg的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸[(1.41±0.24)nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.13±0.05)nmol/mg protein]。在缺氮环境下,Δall0769突变株中检测到(10.00±2.81)nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(29.82±4.04)nmol/mg protein的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸含量[(1.48±0.35)nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.74±0.33)nmol/mg protein]。此外,Δall0769突变株异形胞分化频率(7.12%)显著低于野生型异形胞分化频率(9.22%)。综上所述:文章鉴定了All0769是鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶a合成酶。在鱼腥藻PCC 7120中,缺失乙酰辅酶a合成酶(All0769)会减少乙酰辅酶A的含量,进而下调α-酮戊二酸含量使异形胞频率降低。

关键词：鱼腥藻PCC 7120 乙酰辅酶a合成酶乙酰辅酶A α-酮戊二酸异形胞

特氏杜氏藻中乙酰辅酶a合成酶的基因克隆、表达、纯化及活性测定

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现代食品科技 2017年第3期33卷 67-73页

作者：金宏昊梁明华姜建国华南理工大学食品科学与工程学院广东广州510640

乙酰辅酶a合成酶(ACS)催化合成乙酰辅酶A,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。本研究利用反转录PCR(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离得到了特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)乙酰辅酶a合成酶(Dt ACS)的c DNA全长(2... 详细信息

乙酰辅酶a合成酶(ACS)催化合成乙酰辅酶A,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。本研究利用反转录PCR(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离得到了特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)乙酰辅酶a合成酶(Dt ACS)的c DNA全长(2464 bp),预测其开放阅读框(ORF)为2184 bp,727个氨基酸由此段编码。序列比对显示Dt ACS与绿藻ACS最为相似(与衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;与团藻Volvox carteri ***有70%一致)。选用带有硫氧还蛋白标签(Trx-tag)的pET32a(+)作为原核表达载体,并将Dt ACS转入pET32a(+)中从而构建了pET-32a-Dt ACS质粒。将其转入BL21(DE3)感受态细胞中,同时将pET-32a空载体也转入BL21(DE3)感受态细胞中,分别得到重组菌pET-32a-Dt ACS-BL21(DE3)和对照菌种pET-32a-BL21(DE3)。将重组菌在18℃、终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下诱导12 h,表达出来的带有Trx-His标签融合蛋白的Dt ACS约为8.74 ku(6.99ku+1.75 ku)。此外,将表达得到的重组蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化,纯化后蛋白比活力为52.87 U/mg。

关键词：乙酰辅酶a合成酶特氏杜氏藻基因克隆纯化比酶活

Cancer Cell:乙酰辅酶a合成酶2维持肿瘤细胞存活新机制

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现代生物医学进展 2015年第9期15卷 I0002-I0002页

生长在代谢恶劣环境中的肿瘤细胞往往得到的血液,氧气和营养物质供应非常匮乏,而在接近40%的浸润性导管癌中均发现乙酰辅酶a合成酶2（ACSS2）具有过量高表达。在代谢应激情况下ACSS2促使肿瘤细胞将乙酸作为额外的营养来源使得肿瘤细胞... 详细信息

生长在代谢恶劣环境中的肿瘤细胞往往得到的血液,氧气和营养物质供应非常匮乏,而在接近40%的浸润性导管癌中均发现乙酰辅酶a合成酶2（ACSS2）具有过量高表达。在代谢应激情况下ACSS2促使肿瘤细胞将乙酸作为额外的营养来源使得肿瘤细胞可以适应恶劣代谢环境维持肿瘤细胞存活。近日,国际期刊Cancer cell发表了德国和英国科学家共同合作的这一研究成果。研究人员指出,在许多肿瘤类型中都会有脂肪酸合成通路的选择性激活。

关键词：乙酰辅酶a合成酶肿瘤细胞细胞存活 Cell 机制 2维英国科学家脂肪酸合成

苜蓿根瘤菌乙酰-CoA合成酶的过量表达、纯化及特性

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应用与环境生物学报 2004年第1期10卷 113-115页

作者：戴美学张成刚山东师范大学生命科学学院济南250014

PCR扩增了苜蓿根瘤菌乙酰辅酶a合成酶编码基因 (acsA1) ,克隆到连接 -非依赖型载体pET30LIC ;在E .coliBL2 1(DE3)pLysS中得到了有效表达 ,表达需IPTG的诱导 ,诱导 3h达到酶活高峰 .采用His·Bind柱层析对ACS进行了纯化 ,纯化的酶蛋白经... 详细信息

PCR扩增了苜蓿根瘤菌乙酰辅酶a合成酶编码基因 (acsA1) ,克隆到连接 -非依赖型载体pET30LIC ;在E .coliBL2 1(DE3)pLysS中得到了有效表达 ,表达需IPTG的诱导 ,诱导 3h达到酶活高峰 .采用His·Bind柱层析对ACS进行了纯化 ,纯化的酶蛋白经SDS-PAGE呈单一浓带 ,分子量约 72 0 0 0 ,具较高的酶活 ,是无细胞提取液的 12 .7倍 .酶动力学分析显示 ,Vmax、Km分别为 (4 13.6± 11.7)mmolL-1和 (5 .8± 0 .6 )mmolL-1.图 4表 2参

关键词：苜蓿根瘤菌乙酰辅酶a合成酶过量表达纯化

Dunaliella tertiolecta中乙酰CoA合成酶的基因克隆、表达、纯化及部分酶学性质研究

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Dunaliella tertiolecta中乙酰CoA合成酶的基因克隆、表达、纯化...

作者：金宏昊华南理工大学

学位级别：硕士

乙酰辅酶a合成酶(ACS)催化乙酰辅酶A的合成,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。据报道,过表达ACS会导致醋酸盐大量被转化为acetyl-CoA,从而支持后续的糖酵解途径、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和糖异生作用,并加速细胞生长和物质积累... 详细信息

乙酰辅酶a合成酶(ACS)催化乙酰辅酶A的合成,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。据报道,过表达ACS会导致醋酸盐大量被转化为acetyl-CoA,从而支持后续的糖酵解途径、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和糖异生作用,并加速细胞生长和物质积累。本研究以特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)为主要研究对象,首先利用反转录PCR(RT-PCR)技术得到了长度为1175 bp的DtACS EST序列,该片段经Blast序列比对推断为DtACS基因片段。然后通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了长为790 bp的DtACS 5’端序列和长为784 bp的DtACS 3’端序列,经序列拼接得到DtACS的全长cDNA序列为2464 bp,包含长为2184 bp的DtACS ORF序列,编码727个氨基酸。经氨基酸序列同源性分析,发现DtACS与绿藻ACS最为相似(与衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;与团藻Volvox carteri ***有70%一致)。生物信息学分析结果显示DtACS分子量为79.72 kDa,等电点为6.7,其不稳定指数预测为36.57,属于稳定蛋白质。其主要的结构域有ACS、AMP-binding、PRK00174、AcoAigcsA以及AMP-binding。系统发生树显示Dt ACS与绿藻ACS和链形植物的ACS都较为亲近。选用带有硫氧还原蛋白标签(Trx-tag)的pET32a(+)作为原核表达载体,并将DtACS转入pET32a(+)中从而构建了pET-32a(+)-DtACS质粒。将其转入BL21(DE3)感受态细胞中,同时将pET-32a(+)空载体也转入BL21(DE3)感受态细胞中,分别得到重组菌pET-32a(+)-DtACS-BL21(DE3)和对照菌种pET-32a(+)-BL21(DE3)。将重组菌在18℃、终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下诱导12 h,表达出带有Trx和His标签融合蛋白的DtACS,SDS-PAGE检测出其分子量约为100 kDa,与预测的分子量(79.72 kDa+20 kDa,标签蛋白约为20 kDa)一致。此外,将表达得到的重组蛋白经Ni2+柱纯化,纯化后蛋白比活力为52.8725 U/mg。乙酸钾为底物时,DtACS的Km值为3.597 mM,Vmax为61.73 U/mg。乙酸钠为底物时,DtACS的Km值为4.673 mM,Vmax为59.88 U/mg。DtACS的最适pH为8,最适温度为37℃。

关键词：乙酰辅酶a合成酶特氏杜氏藻基因克隆纯化比酶活

大肠杆菌醛醇脱氢酶的纯化、分析及其在乙酰辅酶A测定中的应用

同方学位论文库评论

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同方学位论文库

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浙江师范大学学报（自然科学版） 2022年第1期45卷 82-87页

作者：孙梅好刘杰袁熹蒲首丞巩菊芳浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004

为了连续测定乙酰辅酶a合成酶(acetyl-CoA synthetase,ACS)催化的乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A,Ac-CoA)合成,探讨以醛醇脱氢酶(aldehyde/alcohol dehydrogenase,AdhE)为偶联酶检测ACS活性的可行性.以大肠杆菌(Escherichia coli K12)基因组为模板扩增、克隆AdhE基因,通过原核表达、纯化获得AdhE,对其进行了酶学动力学分析,并进一步以AdhE为偶联酶对ACS活性进行了测定.结果发现:AdhE的k_(cat)为13.8 min-1,Ac-CoA和NADH的K_(m)分别为52.8和73.4μmol·L^(-1);ACS的k_(cat)为10.5 min^(-1),乙酸和ATP的K_(m)分别为1.31和0.15 mmol·L^(-1).表明基于AdhE的Ac-CoA检测体系切实可用,为Ac-CoA合成反应的连续测定奠定了良好的基础.

关键词：醛醇脱氢酶原核表达乙酰辅酶a合成酶酶活偶联测定

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

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食品与生物技术学报 2020年第5期39卷 16-22页

作者：马文龙刘延峰吕雪芹李江华刘龙堵国成江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因ac... 详细信息

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。

关键词：枯草芽孢杆菌乙酸乙酰辅酶a合成酶 N-乙酰氨基葡萄糖

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嗜盐单胞菌利用乙酸盐合成PHB的研究

化学工业与工程 2022年第5期39卷 119-126页

作者：晋彪张静洪坤强王智文陈涛天津大学化工学院天津300350 系统生物工程教育部重点实验室合成生物学前沿科学中心天津300072

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas ***1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^(-1) 提高到100 g·L^(-1) 时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^(-1) 乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^(-... 详细信息

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas ***1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^(-1) 提高到100 g·L^(-1) 时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^(-1) 乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^(-1) ,其中PHB质量分数为61%,表明该菌株具有很好的高浓度乙酸钠耐受性和利用乙酸合成PHB的特性。随后为进一步提高乙酸钠的利用速度,在TD1.0中分别用高拷贝和低拷贝表达载体表达了来自枯草芽孢杆菌的乙酰辅酶a合成酶基因acs,结果显示,含有高拷贝表达质粒的菌株TD-PN59的乙酸盐平均利用速率为0.91 g·L^(-1) ·h^(-1),比TD1.0提高了19.7%。TD-PN59的细胞干质量和PHB质量分数分别达到9.98 g·L^(-1) 和65%,PHB产量达到6.49 g·L^(-1) ,比TD1.0提高了约10.8%。在以葡萄糖和乙酸钠为混合碳源(10 g·L^(-1) Glu和10 g·L^(-1) NaAC)的培养基中,利用低拷贝载体表达acs的TD-PN85菌株的乙酸钠利用速率显著高于TD1.0,并且在一定程度上缓解了碳分解代谢物阻遏现象(CCR),促进了葡萄糖和乙酸钠的共利用。

关键词：乙酰辅酶a合成酶枯草芽孢杆菌乙酸盐高拷贝乙酸钠混合碳源载体表达摇瓶培养

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

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生物工程学报 2022年第12期38卷 4630-4643页

作者：孔德真李浩李晓杰谢周杰刘浩天津科技大学生物工程学院、天津市工业微生物重点实验室、工业发酵微生物教育部重点实验室、代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多... 详细信息

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现:通过过表达乙酰辅酶a合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34 mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。

关键词：褐黄孢链霉菌纳他霉素前体供给乙酰辅酶a合成酶甲基丙二酰辅酶A变位酶