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从头合成茶氨酸的大肠杆菌工程菌株的构建

从头合成茶氨酸的大肠杆菌工程菌株的构建

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作者：姜灏天津科技大学

学位级别：硕士

L-茶氨酸（N-乙基-γ-L-谷氨酰胺）是一种独特的非蛋白质氨基酸,几乎只存在于茶树（Camellia sinensis）中,是绿茶鲜味的主要来源之一,因此茶叶中茶氨酸的含量对茶叶的质量和价格具有较大影响。除具有较好的风味外,L-茶氨酸在多种动物... 详细信息

L-茶氨酸（N-乙基-γ-L-谷氨酰胺）是一种独特的非蛋白质氨基酸,几乎只存在于茶树（Camellia sinensis）中,是绿茶鲜味的主要来源之一,因此茶叶中茶氨酸的含量对茶叶的质量和价格具有较大影响。除具有较好的风味外,L-茶氨酸在多种动物模型中表现出有益作用,如减少认知功能障碍、增强免疫力、抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等多种作用。基于这些优势,L-茶氨酸被应用于食品、保健品和医药等领域中。目前,利用γ-谷氨酰甲胺合成酶在大肠杆菌中通过外源流加乙胺可迅速的生产茶氨酸,但乙胺沸点较低并且具有毒性,这使得在工业生产中需使用特殊设备,减少乙胺对周围人员和环境造成的危害。为此,本研究利用代谢工程策略,构建了一株大肠杆菌基因工程菌株,能够以葡萄糖为唯一碳源在不添加乙胺的情况下高效合成茶氨酸。本研究采用多模块代谢工程策略构建茶氨酸从头合成生产菌株。在大肠杆菌基因组上多拷贝整合了来源于一株甲基营养菌（Methylovorus mays No.9）的γ-谷氨酰甲酰胺合成酶基因gmas,提高了在外源添加乙胺的情况下茶氨酸的合成效率;引入了一株枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis 168）来源的丙氨酸脱氢酶ala D基因增强了乙胺前体物丙氨酸的供应;以p Trc99a质粒为载体过表达***来源的丙氨酸脱羧酶ala DC基因,在细胞内构建了乙胺合成通路,从而实现了在不添加乙胺的情况下以葡萄糖为碳源从头合成茶氨酸;敲除了茶氨酸降解基因ggt,减少了在发酵过程中茶氨酸的消耗,并通过对质粒进行优化改善了丙氨酸脱羧酶基因的表达;过表达了来源于青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）的磷酸解酮酶基因xfp,避免了丙酮酸生成乙酰辅酶A过程中脱羧步骤带来的碳损失,过表达大肠杆菌自身来源的edd和eda基因强化了丙酮酸的合成;引入了来源于产琥珀酸曼海姆菌（Mannheimia succiniciproducens）的磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因pck A增强了ATP的供应,最终获得了高产茶氨酸的工程菌株。5 L发酵罐发酵48 h可产生92 g/L茶氨酸,糖酸转化率为32%,为目前报道的从头合成茶氨酸的最高水平。

关键词： L-茶氨酸丙氨酸脱羧酶乙胺合成途径 γ-谷氨酰甲胺合成酶

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代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-茶氨酸

代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-茶氨酸

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作者：季圆清天津科技大学

学位级别：硕士

L-茶氨酸是L-谷氨酸的衍生物,主要存在于茶树(Camellia sinensis)中,它和茶多酚等物质共同赋予了茶叶独特的口感和风味,同时也成为评价茶叶质量的主要参数。L-茶氨酸在临床试验中也表现出很多正向的结果,如降血压、抑制肺癌细胞的侵袭... 详细信息

L-茶氨酸是L-谷氨酸的衍生物,主要存在于茶树(Camellia sinensis)中,它和茶多酚等物质共同赋予了茶叶独特的口感和风味,同时也成为评价茶叶质量的主要参数。L-茶氨酸在临床试验中也表现出很多正向的结果,如降血压、抑制肺癌细胞的侵袭迁移、减少抗癌药物的副作用、保护神经细胞和安神助眠等。因此,在国外L-茶氨酸也被当作膳食补剂广泛地应用到食品、保健品和医药领域中。2014年,我国也正式批准L-茶氨酸可以作为新食品原料来使用。2020年,我国L-茶氨酸产量达到682.9吨,占全球总产量的77.89%。随着市场需求量的急速增长,寻找创新的生产方式来提高L-茶氨酸产能和生产经济性是目前面临的首要问题。目前利用γ-谷氨酰甲胺合成酶耦联ATP再生系统可实现L-茶氨酸的生物合成,最高产量可达104 g/L,但酶催化过程中存在许多问题,如催化体系复杂、底物价格昂贵、酶制备和酶反应需要分步进行、设备占用率高等,因此需要借助微生物发酵法来优化生产路线,简化操作步骤,进一步降低生产成本。利用合成生物学和代谢工程策略,本研究开发了一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成L-茶氨酸的方法。通过系统代谢工程改造,构建了一株能够高效利用葡萄糖和乙胺发酵生产L-茶氨酸的工程菌株。首先,增加Paracoccusa minovorans来源的γ-谷氨酰甲酰胺合成酶基因gmas的拷贝数,提高L-茶氨酸的合成效率;其次,引入来源于Bifidobacterium adolescentis的6-磷酸果糖解酮酶基因xfp,建立从6-磷酸果糖到乙酰磷酸和5-磷酸木酮糖到乙酰磷酸的途径,避免糖酵解途径中丙酮酸脱羧步骤带来的碳损失;然后增强柠檬酸合酶基因glt A和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc的表达量,加快乙酰辅酶A进入TCA循环;随后,敲除乙酸激酶基因ack A,增强乙酰辅酶A合成酶基因acs和乙酰基转移酶基因pta的表达量来增加乙酰磷酸到乙酰辅酶A的代谢流,并且减少副产物乙酸的积累。最后通过优化发酵培养基配方和设置乙胺控制阀,在5 L发酵罐中确定了乙胺的最优流加方案:菌体OD值达到15后,开始流加260 g/L的乙胺溶液,根据OD的变化量调整乙胺的实时流速。在上述发酵条件下,工程菌THEA8发酵24 h可以产生94 g/L的L-茶氨酸,糖酸转化率达到了56.9%,乙酸浓度在1 g/L以下。乙胺是合成L-茶氨酸的前体物,但其具有极强的易燃性和毒性。为了减少在生产过程中流加乙胺,在工程菌THEA3-2的基础上,引入从乙酰辅酶A到乙胺的合成途径。首先,将来源于Pseudomonas putida的转氨酶基因spu C整合至大肠杆菌基因组中,构建乙醛到乙胺的代谢途径;然后,增强丙氨酸脱羧酶编码基因eut E的表达量,为转氨酶催化反应提供充足的底物;随后,整合来源于Lysinibacillus sphaericus的丙氨酸脱氢酶编码基因al D,增强丙酮酸到丙氨酸的代谢流,与转氨酶催化丙氨酸生成丙酮酸形成互补关系,弥补单一反应造成的丙氨酸亚适量。通过上述策略构建的工程菌THEB3,在不添加乙胺的条件下,摇瓶发酵L-茶氨酸产量达到5.91 g/L。

关键词： L-茶氨酸代谢工程 γ-谷氨酰甲胺合成酶乙胺合成途径发酵优化

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