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LTQ-FT-MS技术结合生物信息学筛选与HBV Polymerase存在潜在相互作用的宿主蛋白

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病毒学报 2014年第6期30卷 636-644页

作者：凌梦婷宫君原李君武周天鸿暨南大学生命科学技术学院广州510632

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是慢性肝病的一个主要致病因素,易导致肝炎、肝硬化,并最终导致肝癌。乙型肝炎病毒聚合酶(HBV Polymerase,Pol)在HBV复制过程中起着关键作用,并有可能参与肝癌的发生。Pol的这些生理功能很有可能是... 详细信息

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是慢性肝病的一个主要致病因素,易导致肝炎、肝硬化,并最终导致肝癌。乙型肝炎病毒聚合酶(HBV Polymerase,Pol)在HBV复制过程中起着关键作用,并有可能参与肝癌的发生。Pol的这些生理功能很有可能是通过与蛋白质之间的相互作用来行使的。本文通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术,筛选、鉴定与Pol存在潜在相互作用的蛋白。用构建好的pcDNA3.1-POL-flag重组质粒转染HeLa细胞,LC-MS/MS技术筛选能与融合flag标签的Pol发生免疫共沉淀的蛋白,共得到45个蛋白,其中11个蛋白被报道能与Pol发生相互作用。Ingenuity Pathway Analysis(IPAR○)软件进一步分析45个蛋白与Pol的功能及相应的细胞网络,发现这些蛋白涉及三个大分子网络,其中4个蛋白可能参与协助Pol在细胞网络中行使其生理功能,对这4个蛋白的进一步研究将有助于为攻克乙型肝炎病提供线索。

关键词： LTQ-FT-MS 乙型肝炎病毒聚合酶相互作用

荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法在临床的应用评价

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世界华人消化杂志 2005年第11期13卷 1291-1294页

作者：张淑云刘伟李迪谷鸿喜仰曙芬周志红杜博金茜常曼丽哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心黑龙江省哈尔滨市150086 哈尔滨医科大学微生物学教研室黑龙江省哈尔滨市150086

目的:对国产荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH—PCR—MC)检测乙型肝炎病毒聚合酶酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸基序(HBVYMDD)变异的试剂进行临床应用评价.方法:慢性乙型肝炎患者外周血浆标本217份,分别采用荧光标记Taqman探... 详细信息

目的:对国产荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH—PCR—MC)检测乙型肝炎病毒聚合酶酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸基序(HBVYMDD)变异的试剂进行临床应用评价.方法:慢性乙型肝炎患者外周血浆标本217份,分别采用荧光标记Taqman探针定量PCR法(FT—PCR)和荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH—PCR—MC)检测HBVDNA含量和YMDD及其变异;其中78份HBVDNA阳性标本采用基因型特异性多引物对巢式PCR法进行基因分型(A—F),30份标本用PCR产物克隆测序法检测HBVYMDD及其变异.结果:血浆标本HBVDNA阳性率(≥1.0×106copies/L)为75.6%(164/217).YMDD及其变异检出率为67.7%(147/217).其中YMDD44.9%(66/147),YIDD22.5%(33/147).YVDD17.7%(26/147),YIDD/YVDD混合株10.9%(16/147),其他混合株4.0%(6/147);结合HBVDNA含量,HBVYMDD及其变异的检出下限为HBVDNA=5.0×106copies/L,但在106copies/L时检出率较低,仅为36.4%,随着HBVDNA含量增高,检出率显著增高(>80%),且在107copies/L时即有显著增高(χ2=7.177,P<0.01).在基因分型的78份标本中,C基因型占89.8%,B和D基因型分别占8.9%和1.3%,YMDD及其变异总检出率为100%,变异总检出率为59.0%;1份D基因型YMDD及其变异检测为YIDD/YVDD混合变异;B,C两种基因型变异检出率分别为71.4%和55.7%,但二者无统计学差异.以测序法的检测结果为相对标准,则FH—PCR—MC法检测HBVYMDD及其变异的相对敏感性、特异性和符合率分别为96.3%(26/27),100%(3/3)和96.7%(29/30);对于HBVYMDD及其变异的类型,两种方法检测结果一致.结论:FH—PCR—MC法是一种快速、特异的HBVYMDD及其变异检测方法,具有较高的检出率,且能区分YMDD及其变异的类型.

关键词：荧光标记曲线法双探针融解杂交乙型肝炎病毒聚合酶慢性乙型肝炎患者 DNA含量 YMDD 天门冬氨酸临床应用评价定量PCR法 Taqman 巢式PCR法 HBV 血浆标本基因分型 D基因型总检出率检测结果克隆测序法 PCR产物基因型变异

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HBV对RIG-Ⅰ信号通路的影响机制

生物医学工程学杂志 2012年第5期29卷 995-998,1013页

作者：严丽波黄飞骏(综述) 唐红(审校) 四川大学华西医院感染性疾病中心成都610041 四川大学生物治疗国家重点实验室感染性疾病研究室成都610041 四川大学华西基础医学与法医学院法医病理教研室成都610041

感染乙型肝炎病毒(HBV)后对天然免疫应答的影响在HBV感染慢性化中可能起着起着重要的作用,而维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)介导的信号通路是天然免疫最重要的通路之一。X蛋白(HBx)以及HBV聚合酶在HBV对RIG-Ⅰ信号通路的影响机制中发挥着重... 详细信息

感染乙型肝炎病毒(HBV)后对天然免疫应答的影响在HBV感染慢性化中可能起着起着重要的作用,而维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)介导的信号通路是天然免疫最重要的通路之一。X蛋白(HBx)以及HBV聚合酶在HBV对RIG-Ⅰ信号通路的影响机制中发挥着重要的作用。本文对近年来有关HBV对RIG-Ⅰ信号通路的作用及可能机制的研究进展做一综述。

关键词：乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒聚合酶维甲酸诱导基因Ⅰ 天然免疫 X蛋白

乙肝病毒聚合酶与人核不均一性核糖核蛋白KI结构域之间相互作用的研究

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乙肝病毒聚合酶与人核不均一性核糖核蛋白KI结构域之间相互作用的...

作者：凌梦婷暨南大学

学位级别：硕士

目的:已有研究证明乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)聚合酶Polymerase(Pol)与人核不均一性核糖核蛋白(hn RNPK)之间存在相互作用。大量文献表明,hn RNPK的KI结构域为蛋白相互作用结构域,为了探寻Pol与hn RNPK的相互作用是否是通过K... 详细信息

目的:已有研究证明乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)聚合酶Polymerase(Pol)与人核不均一性核糖核蛋白(hn RNPK)之间存在相互作用。大量文献表明,hn RNPK的KI结构域为蛋白相互作用结构域,为了探寻Pol与hn RNPK的相互作用是否是通过KI结构域进行的,拟分别构建缺失KI结构域的hn RNPK重组质粒以及单独的KI结构域的重组质粒,通过GST-pulldown结合Co-immunoprecipitation(co-ip)的方法检测其与Pol之间的相互作用。该研究旨在探寻宿主蛋白hn RNPK与pol的相互作用结构域,拟为探明HBV Pol与hn RNPK的相互作用机制,寻找乙肝病毒治疗新靶标提供理论基础。方法:1)本文先构建缺失KI结构域的hnRNPK重组质粒pGEX-4T-1-ΔKI,IPTG诱导GST-ΔKI融合蛋白表达,通过GST-pulldown实验发现其与Pol不存在直接的相互作用。2)构建融合HA标签的KI结构域缺失型hn RNPK真核表达重组质粒pc DNA3.1-ΔKI-HA,与Pol-flag共转Hela细胞后,通过co-ip实验检测KI缺失型hn RNPK在细胞生理环境中能否与Pol发生相互作用,并验证GST-pulldown的结果。3)为了进一步探索KI结构域是否是hn RNPK与Pol相互结合时的主要结构域,本文构建了只含有KI结构域的重组质粒p GEX-4T-1-HD,IPTG诱导GST-HD融合蛋白表达,通过GST-pulldown实验检测其与Pol的相互作用。4)构建融合了HA标签的KI结构域重组质粒pc DNA3.1-HD-HA,与Pol-flag共转Hela细胞,运用co-ip技术检测KI单独结构域在细胞生理环境中能否与Pol发生相互作用,并验证GST-pulldown的结果。结果:p GEX-4T-1-ΔKI与pc DNA3.1-ΔKI-HA重组质粒构建成功,通过GST-pulldown与co-ip实验均发现缺失了KI结构域的hn RNPK不能与Pol发生相互作用。p GEX-4T-1-HD与pc DNA3.1-HD-HA重组质粒构建成功,通过GST-pulldown与co-ip实验检测到其与Pol存在相互作用。结论:分别检测缺失KI结构域的hn RNPK与单独的KI结构域同Pol之间的相互作用,发现了在缺失KI结构域的情况下,hn RNPK丧失了与Pol相互作用的能力,而其单独的KI结构域能够保持与Pol的相互作用,说明hn RNPK主要通过其KI结构域与Pol发生相互作用。该研究为揭示hn RNPK参与协助Pol行使其功能的机理奠定了基础。

关键词：乙型肝炎病毒聚合酶人核不均一性核糖核蛋白 KI结构域蛋白相互作用

HBV聚合酶活性区变异与临床病情变化及HBsAg阳性相关性

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中南医学科学杂志 2019年第3期47卷 291-293,317页

作者：夏红杨强重庆市大足区人民医院感染科

研究乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶活性区变异与临床病情变化及乙肝表面抗原(HBsAg)阳性的相关性。290例慢性乙型肝炎患者,HBV聚合酶活性区变异140例,其余无变异;分析HBV聚合酶活性区变异与肝功能及HBsAg阳性表达的关系。变异组患者的天门冬... 详细信息

研究乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶活性区变异与临床病情变化及乙肝表面抗原(HBsAg)阳性的相关性。290例慢性乙型肝炎患者,HBV聚合酶活性区变异140例,其余无变异;分析HBV聚合酶活性区变异与肝功能及HBsAg阳性表达的关系。变异组患者的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALB)和总胆红素(TBIL)肝功能指标水平显著高于无变异组(P聚合酶活性区变异的乙肝患者临床病情更重,HBV表面抗原阳性表达比例低。

关键词：乙型肝炎病毒聚合酶临床病情乙型肝炎病毒表面抗原相关性