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微生物学报 2004年第6期44卷 771-774页

作者：李迎丽张惟材汪建华黄留玉军事医学科学院生物工程研究所

节杆菌BT80 1的乙内酰脲酶系能够水解 5 苄基乙内酰脲生成L 苯丙氨酸 ,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到... 详细信息

节杆菌BT80 1的乙内酰脲酶系能够水解 5 苄基乙内酰脲生成L 苯丙氨酸 ,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因 (hyuH) ,置于表达载体pT2 2 1的T7启动子下游 ,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL2 1(DE3)。SDS PAGE分析在相对分子量 5 0kD处有一较强的表达带 ,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的 4 0 % ,主要以可溶性形式存在。

关键词：乙内酰脲酶乙内酰脲水解酶基因表达

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节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化

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生物技术通讯 2008年第6期19卷 852-854页

作者：李洪贞张惟材汪建华熊向华军事医学科学院生物工程研究所北京100071 沈阳药科大学辽宁沈阳110016

目的:构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶(HyuH)与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法:将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的H... 详细信息

目的:构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶(HyuH)与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法:将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂纯化融合蛋白GST-HyuH。结果:SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77×103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白。结论:得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础。

关键词：乙内酰脲水解酶融合表达纯化

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乙内酰脲酶的基因表达及菌种筛选

乙内酰脲酶的基因表达及菌种筛选

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作者：王婕沈阳药科大学

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乙内酰脲酶是一类用于手性氨基酸生产的酶。本研究包括L-乙内酰脲酶和D-乙内酰脲酶两个部分研究。建立了一个可行的筛选模型，从不同地区采集土样，利用5-对羟基苯基乙内酰脲为惟一氮源进行土样富集，在筛选平板上经过初筛后，获... 详细信息

乙内酰脲酶是一类用于手性氨基酸生产的酶。本研究包括L-乙内酰脲酶和D-乙内酰脲酶两个部分研究。建立了一个可行的筛选模型，从不同地区采集土样，利用5-对羟基苯基乙内酰脲为惟一氮源进行土样富集，在筛选平板上经过初筛后，获得49株候选菌株，通过检测中间产物和终产物进行复筛，结果筛选得到1株活性最强的产酶菌株BT821。该菌能将DL-对羟基苯基乙内酰脲不对称水解为D-对羟基苯甘氨酸。通过化学合成和基因拼接方法获得了编码一种耐热D-乙内酰脲酶的基因，并对其活性做了初步研究，结果表明，该D-乙内酰脲水解酶活性在55℃下比在37℃时更高。通过PCR获得编码硫氧还蛋白结构基因，置T5启动子之下，再连接至低拷贝质粒pOK12上，构建得到能够单独表达硫氧还蛋白且与pUC或pQE质粒相容的质粒。利用双质粒系统同时表达目的蛋白和伴侣分子硫氧还蛋白，可实现目的蛋白的可溶表达，减少包涵体形成。通过PCR扩增得到BT811的D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶的结构基因，分别置于表达载体pT221(含有一种分子伴侣的质粒)的T7和pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pT221-hyuH和pQE60-hyuC，并分别在大肠杆菌BL21(DE3)和JM109中实现了两个基因的表达。SDS-PAGE检测表达产物，在相对分子量53kD和45kD处分别有一表达带，与BT811的D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶的一级结构预测分子量53.0kD和45.2kDa相符。通过PCR扩增得到BT801 L-氨甲酰化酶的结构基因，将该基因置于原核表达载体pQE60的强启动子T5启动子控制之下，加上组氨酸标签，实现了该酶在大肠杆菌JM109中的表达，SDS-PAGE结果显示在44KD处有表达带，这与氨甲酰化酶的一级结构预测分子量相符(44413 D)。纯化了该酶，纯化后的酶是初始菌活性的144倍。用100mmol／L的NaHCO和100μmol／L的Co对BT801的L-乙内酰脲水解酶进行了激活。

关键词：乙内酰脲水解酶氨甲酰化酶表达筛选

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乙内酰脲酶的基因表达及菌种筛选

乙内酰脲酶的基因表达及菌种筛选

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作者：李迎丽西北农林科技大学

学位级别：硕士

乙内酰脲酶是广泛存在于动物、植物和微生物的一类酶系，包括乙内酰脲水解酶(hydantoin hydrolase，HyuH)和N-氨甲酰基氨基酸水解酶(N-carbamoylase，HyuC)，有些情况下还包括乙内酰脲消旋酶(hydantoin racemase，HyuR)。在上述几种酶... 详细信息

乙内酰脲酶是广泛存在于动物、植物和微生物的一类酶系，包括乙内酰脲水解酶(hydantoin hydrolase，HyuH)和N-氨甲酰基氨基酸水解酶(N-carbamoylase，HyuC)，有些情况下还包括乙内酰脲消旋酶(hydantoin racemase，HyuR)。在上述几种酶的协同作用下，5-位单取代乙内酰脲类化合物被水解为相应的L-或D-型氨基酸，因此该酶在光学活性氨基酸的酶法生产中具有广阔的应用前景。 1．节杆菌(Arthrobacter)BT801是由军事医学科学院生物工程研究所保存的L-乙内酰脲酶产酶菌株，pUC18-169是由本室构建的含有节杆菌BT801的L-乙内酰脲酶完整操纵子序列的亚克隆质粒。节杆菌BT801的乙内酰脲水解酶催化乙内酰脲类化合物水解开环，N-氨甲酰基氨基酸水解酶是该菌乙内酰脲酶系中惟一具有立体选择性的酶，也是整个反应体系的限速酶。用PCR技术从质粒pUC18-169中扩增出L-乙内酰脲水解酶基因(hyuH)和N-氨甲酰基氨基酸水解酶基因(hyuC)，分别在大肠杆菌和毕赤酵母中实现了活性表达。将PCR扩增得到的hyuH DNA片段分别置于载体质粒pQE60的T5启动子和pT221的T7启动子下游，构建了单独表达质粒pQE60-hyuH和融合表达质粒pT221-hyuH，并对两种重组质粒的表达产物进行了可溶性分析和活性测定。结果表明，SDS-PAGE分析在50kD处有一较强的表达带，融合有分子伴侣的重组菌株BL21(DE3)／pT221-hyuH与非融合表达的重组菌株M15／pQE60-hyuH相比，乙内酰脲水解酶的表达量低一些，但其表达蛋白主要以可溶性形式存在，而M15／pQE60-hyuH中表达蛋白则主要以包含体形式存在，且前者的酶活性是后者的2倍多。将hyuC DNA片段连接到真核表达载体pPIC3.5K上，经Bgl Ⅱ酶切线性化，通过PEG法转化导入毕赤酵母GS115感受态细胞，利用G418抗性筛选得到12个插入多拷贝目的基因的转化子。酶活性分析表明，所得转化子具有N-氨甲酰基氨基酸水乙内酞服酶的基因表达和菌种筛选解酶活性，可将N一氨甲酞基苯丙氨酸水解为苯丙氨酸，酶的比活分别是原始菌株节杆菌BT8ol和亚克隆DHS创pUC 18一169的2.26和2.15倍。 2.建立了一个可行的筛选模型，从不同区域采集土样，以5一苯基乙内酞服为唯一氮源进行土样富集，通过平板筛选法进行初筛后，得到23株候选菌株，通过检测中间产物和终产物的产生进行复筛，结果初步确定了1株乙内酞脉酶产酶菌株，编号为BTS 11。后经基因分离和序列分析，证实BT8ll为1株新的D一乙内酞脉酶产酶菌株。

关键词：乙内酰脲酶乙内酰脲水解酶 N-氨甲酰基氨基酸水解酶表达筛选

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