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广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

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中山大学学报（医学科学版） 2008年第3期29卷 264-269页

作者：王波李月琴胡兢晶苏海浩何震宇田传军张纯青叶铁真周天鸿广东省妇幼保健院儿科广东广州510010 暨南大学生命科学院广东广州510632 广州呼吸疾病研究所国家重点实验室广东广州510120

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株,经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D5... 详细信息

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株,经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增,PCR产物纯化后进行基因克隆,构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒;基因测序;将HCMVUL137基因序列呈报GenBank,并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录,收录序列号分别为:DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析,结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守,同源性在96.91%～100%之间,其变异均为碱基替换;编码蛋白均由96个氨基酸残基组成,同源性在90.63%～100%之间,超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间;编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类,其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守,cAMPs位点仅在5株病毒出现;编码蛋白等电点在11.50～12.00之间,呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守,但仍存在一定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是一个具有重要功能的基因。

关键词：人巨细胞病毒临床病毒株低传代 UL137 基因序列基因多态性

应用EGS基因沉默技术研究人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因功能

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应用EGS基因沉默技术研究人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因功能

作者：胡兢晶广州医学院

学位级别：硕士

目的研究外部引导序列(External Guide Sequences,EGS)对人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)临床病毒株UL148基因表达的抑制作用,为探讨UL148基因功能奠定基础,为抗HCMV治疗寻找新的治疗途径。方法细胞外实验:1.根据靶基因UL... 详细信息

目的研究外部引导序列(External Guide Sequences,EGS)对人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)临床病毒株UL148基因表达的抑制作用,为探讨UL148基因功能奠定基础,为抗HCMV治疗寻找新的治疗途径。方法细胞外实验:1.根据靶基因UL148序列特征设计并合成DNA性质EGS;2.从HCMV临床病毒株基因组中扩增UL148基因,克隆入pGEM-T-EASY质粒, PCR扩增UL148小片段,制备底物转录模板,参入32P-UTP后体外转录;3.从大肠杆菌DH5α基因组扩增M1RNA基因,将其克隆入pUC18质粒,线性化后,体外合成M1RNA;4.将底物UL148 RNA、EGS、M1RNA混合于切割反应液,37℃反应1h,以聚丙烯酰胺凝胶分离产物,应用Typhoons扫描仪分析切割结果。细胞内实验:将UL148基因克隆入pEGFP-N1质粒,重组质粒转染HeLa细胞,同时以pEGFP-N1质粒转染HeLa细胞作为阴性对照,均以1mg/mL G418筛选4周。选取细胞外实验证实有切割作用的EGS4,分别以50nM、100nM、200nM、400nM终浓度转染G418筛选后的细胞。应用荧光显微镜观察上述细胞荧光量的变化;应用荧光定量PCR进行绝对定量,分析EGS4对UL148表达量的沉默效果。结果细胞外实验:1.共设计5条EGS;2.成功构建pT148重组质粒,PCR后扩增获得UL148小片段转录模板,经体外转录获得32P标记的UL148小片段RNA;3.成功构建pUC-M1重组质粒,线性化后,体外转录合成M1RNA;4.在细胞外进行切割实验,筛选出多条具有特异性切割UL148 RNA的EGS。细胞内实验:成功构建p148-EGFP重组质粒;重组质粒p148-EGFP及pEGFP-N1质粒分别转染HeLa细胞,经G418筛选后,成功构建稳定表达UL148基因的HeLa细胞系(UL148-HeLa)和稳定表达EGFP的HeLa细胞系(EGFP-HeLa)。荧光显微镜观察50nM、100nM、200nM、400nM的EGS4作用后,UL148-HeLa细胞的荧光量明显减少,而EGFP-HeLa细胞荧光量无明显改变。荧光定量PCR分析显示50nM、100nM、200nM、400nM EGS4对UL148的抑制效率分别为74.9 %(P<0.05)、78.6%(P<0.05)、81.1%(P<0.05)、87.0%(P<0.05)。结论 1.经细胞外实验筛选出2条具有特异性切割UL148 RNA作用的EGS,分别为EGS1和EGS4;2.在细胞内EGS4能有效沉默HCMV UL148基因的表达,并随浓度的增加,沉默效果逐渐明显;3.细胞外EGS切割实验系统可作为细胞内切割实验前的一种有效筛选途径;4.经细胞外和细胞内切割实验筛选出的有效EGS,可用于研究UL148的基因功能,并且有望发展成为抗HCMV的小分子核酸药物。

关键词：人巨细胞病毒临床病毒株低传代 UL148 外部引导序列基因沉默先天感染

广州地区人巨细胞病毒临床低传代病毒株D3的UL147基因B细胞抗原表位的生物信息学分析

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中国病毒病杂志 2017年第3期7卷 191-196页

作者：晏翠芳郭梦杰伍苑宾胡兢晶苏海浩谭琪琪梁惠慈肖华王波广州市妇女儿童医疗中心神经康复科广东广州510181 广东省妇幼保健院小儿呼吸科广东广州511442

目的应用生物信息学方法分析广州地区人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)临床低传代病毒株D3的UL147基因B细胞抗原表位。方法应用生物信息学方法:用TMHMM预测跨膜区域,用改进型自我优化预测结构(SOPMA)、Garnier-Osguthorpe-Robs... 详细信息

目的应用生物信息学方法分析广州地区人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)临床低传代病毒株D3的UL147基因B细胞抗原表位。方法应用生物信息学方法:用TMHMM预测跨膜区域,用改进型自我优化预测结构(SOPMA)、Garnier-Osguthorpe-Robson(GOR)法、人工神经网络预测法(HNN)预测二级结构,用Hopp&Woods亲水性方案、Janin可及性方案、Welling抗原性方案等参数预测UL147基因抗原表位。结果临床低传代HCMV病毒株D3的UL147基因包含159个氨基酸残基,等电点为9.56;UL147存在一个跨膜区域,为20~42aa区域,胞外区域为1~19aa区域;无规则卷及β-转角区域主要位于12~17、22~28、31~48、99~109、130~145aa区域;亲水性位于15~39、101~111、135~143aa区域;可及性位于14~45、103~124、131~143aa区域;抗原性位于9~14、63~70、108~116aa区域。结论临床低传代HCMV病毒株UL147基因抗原表位可能位于7~12aa区域或其附近。

关键词：人巨细胞病毒 UL147基因抗原表位临床病毒株

人巨细胞病毒临床低传代病毒株D2的UL140基因B细胞表位生物信息学特征

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中华妇幼临床医学杂志（电子版） 2017年第6期13卷 658-662页

作者：苏海浩王波郭梦杰谭琪琪胡兢晶伍苑宾晏翠芳广东省妇幼保健院小儿呼吸科广州511442 广州市妇女儿童医疗中心神经康复科 510180

目的探讨广东省妇幼保健院分离鉴定的人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代病毒株D2(以下简称为HCMV D2)的UL140基因B细胞表位的生物信息学特征。方法采用2016年3月至2017年3月,于广东省妇幼保健院新生儿科确诊感染HCMV的10例新生儿新鲜尿液标... 详细信息

目的探讨广东省妇幼保健院分离鉴定的人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代病毒株D2(以下简称为HCMV D2)的UL140基因B细胞表位的生物信息学特征。方法采用2016年3月至2017年3月,于广东省妇幼保健院新生儿科确诊感染HCMV的10例新生儿新鲜尿液标本中,分离鉴定的HCMV D2为研究材料。采用生物信息学方法,包括隐马尔可夫模型(TMHMM)预测HCMV D2 UL140基因跨膜结构,ExPASy在线序列分析平台预测基因的亲水性、表面可及性、极性、柔韧性及抗原性参数,以及GOR(Garnier-Osguthorpe-Robson)、人工神经网络预测法(HNN)、改进型自我优化预测结构(SOPMA)预测UL140基因二级结构。综合分析上述预测结果,并计算UL140基因的氨基酸残基抗原指数(AI),总结UL140基因B细胞表位的生物信息学特征。结果来自广东省妇幼保健院感染HCMV新生儿的HCMV D2 UL140基因的氨基酸包含191个氨基酸残基,相对分子质量为21.5×103,等电点为5.12。UL140基因B细胞表位的生物信息学特征包括:(1)TMHMM预测UL140基因存在1个跨膜区域,为26-48aa,细胞外区域为1-25aa。(2)ExPASy在线序列分析平台预测UL140基因的亲水性位于14-22、66-72、76-95、113-125、136-148、55-160、167-176aa;表面可及性位于5-22、50-60、64-96、132-160、167-187aa;极性位于5-22、45-98、103-128、132-187aa;柔韧性位于16-26、75-100、104-113、136-160aa;抗原性位于9-18、53-58、82-88、115-124、136-146、164-187aa。(3)UL140基因二级结构预测结果为,无规则卷及β-转角主要位于1-8、13-25、79-95、103-113、153-159aa。(4)计算UL140基因氨基酸残基的AI较高区域的结果显示,5-10、14-22aa区域的AI较高。结论 HCMV D2 UL140基因B细胞表位,可能位于的区域为5-10、14-22aa或其附近。

关键词：巨细胞病毒临床病毒株 UL140基因 B细胞表位婴儿新生

EGS体外抑制人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因表达的研究

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EGS体外抑制人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因表达的研究

应用EGS引导核酶P高效抑制HCMV临床病毒株UL148基因表达

广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会

作者：胡兢晶苏海浩丁俊彩郭媛媛谢斌华伍苑宾密英鸽王波广东省儿童医院·广东省妇幼保健院儿科

背景由于临床低传代病毒株分离率低,传代次数受到限制,在大量HCMV的基础研究中,多选取实验室病毒株为研究对象。但实验室病毒株在体外反复传代的过程中随着部分基因的丢失,使其生物学特性发生改变,与致病的临床病毒株存在较大的差异。... 详细信息

背景由于临床低传代病毒株分离率低,传代次数受到限制,在大量HCMV的基础研究中,多选取实验室病毒株为研究对象。但实验室病毒株在体外反复传代的过程中随着部分基因的丢失,使其生物学特性发生改变,与致病的临床病毒株存在较大的差异。在研究病毒致病机制方面,实验室病毒株显示出一定的局限性。另一方面实验室病毒株无法满足对缺失基因研究的需要。研究显示,缺失部分的基因主要集中在UL/b’区域,推测此区域与病毒的致病性密切相关,也是HCMV致病机制研究的焦点。目的为研究人巨细胞病毒临床病毒株UL/b’区域UL148基因功能,设计DNA性质EGS在体外抑制UL148基因的表达。方法应用RNA structure技术模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS。应用PCR的方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以P标记进行体外转录。在切割反应液中,混合EGS、M1RNA,反应1小时后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果。结果根据UL148 RNA二级结构选取第58-72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57:UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的径环结构。在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符。经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带。结论EGS57可高效切割UL148 RNA,其切割位点准确,与预期相符。该研究可为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具,也为明确HCMV基因功能奠定基础。

关键词：人巨细胞病毒外部引导序列 UL148 临床病毒株

来源： cnki会议评论

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应用EGS引导核酶P高效抑制HCMV临床病毒株UL148基因表达

广州地区人巨细胞病毒临床低传代株UL138基因的序列特征及多态性分析

广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会

作者：胡兢晶苏海浩丁俊彩郭媛媛谢斌华伍苑宾密英鸽王波广东省儿童医院·广东省妇幼保健院儿科

背景目前,婴幼儿HCMV感染的发病率逐年升高,婴儿先天性感染往往导致先天畸形、耳聋、智力障碍等严重后遗症,甚至死亡。有效防治或阻断HCMV先天感染对提高儿童健康水平、生活质量方面具有重大意义。随着病毒部分分子机制的明确,目前治疗H... 详细信息

背景目前,婴幼儿HCMV感染的发病率逐年升高,婴儿先天性感染往往导致先天畸形、耳聋、智力障碍等严重后遗症,甚至死亡。有效防治或阻断HCMV先天感染对提高儿童健康水平、生活质量方面具有重大意义。随着病毒部分分子机制的明确,目前治疗HCMV感染已取得了重大成效,但HCMV耐药株的出现及抗HCMV药物的副作用,使其在儿童和孕妇感染者中的使用受到一定的限制。防治婴儿HCMV感染尚无有效策略,阻断母婴传播,降低婴儿先天性HCMV感染仍是世界性难题。目的探讨外部引导序列(externa1 guide sequencees,EGSs)基因沉默技术对人巨细胞病毒临床病毒株特有基因UL148表达的抑制作用,以探索抗HCMV治疗的新途径,为开发新型反义核酸药物奠定基础。方法细胞外研究:应用RNA structure技术模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域,以第362位为切割位点设计并合成DNA性质EGS362。体外扩增UL148基因及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148 RNA以P标记。将P标记的UL148RNA及M1RNA混合至体外反应液中,进行EGS的引导下进行细胞外切割反应。细胞内研究:扩增UL148基因克隆至pEGFP-N1载体,构建UL148真核表达载体。将UL148真核表达载体转染Hela细胞,构建稳定表达UL148基因的细胞株,经荧光显微镜观察及RT-PCR的方法鉴定UL148 RNA在Hela细胞内的表达。将EGS362转染稳定表达UL148基因的Hela细胞株,分别以荧光显微镜及荧光定量PCR分析EGS362在真核细胞内对UL148表达的沉默效果。结果细胞外研究:经RNA structure技术体外模拟EGS362可于UL148 RNA形成类似M1RNA天然作用底物的径环结构,易于M1RNA的识别及切割。在细胞外获得UL148 RNA及M1RNA,经体外切割反应,可获得与预期大小相符的切割条带,证实DNA性质EGS362可特异性地切割UL148 RNA,其切割位点准确,与预期相符。细胞内研究:经UL148真核表达载体转染Hela细胞,经荧光显微镜观察可观察到绿色荧光,应用RT-PCR鉴定UL148基因在真核细胞中稳定表达,证实稳定表达UL148的Hela细胞系构建成功。分别以50nM、100 nM、200 nM、400 nM EGS362转染Hela细胞后,以荧光显微镜观察,绿色荧光蛋白较前明显下降,经荧光定量PCRUL148分析,其表达率下降分别为74.9%、78.6%、81.1%、87%。结论EGS362能准确的切割目标基因UL148 RNA,其准确性可精确到单个碱基的水平;经体外筛选出的EGS362能进一步在细胞内沉默UL148基因的表达;EGS362的沉默效率与其浓度成正相关;EGS362发展成为UL148的理想沉默工具;该研究也为明确该基因的功能奠定基础。

关键词：人巨细胞病毒外部引导序列 UL148 临床病毒株核酶P

来源： cnki会议评论

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第6期35卷 407-413页

作者：蔡丽君胡兢晶王波苏海浩伍苑宾密英鸽郭梦杰广州医科大学附属广东省妇儿医院儿科 511442 广东省妇幼保健院儿科广州511442

目的研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL138基因序列特征与多态性。方法从10例被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离HCMV低传代临床病毒株，进行多重PCR鉴定。对临床分离株进行HCMVUL138基因扩增、... 详细信息

目的研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL138基因序列特征与多态性。方法从10例被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离HCMV低传代临床病毒株，进行多重PCR鉴定。对临床分离株进行HCMVUL138基因扩增、克隆、鉴定、测序及呈报GenBank；同时在GenBank搜索HCMVUL138同源序列，行序列分析，应用生物信息学在线软件分析UL138基因翻译后修饰位点、二级结构及等电点。结果成功分离3株HCMV临床病毒株，分别命名为HCMVD3、D2和D52。克隆测序后呈报GenBank并被收录。收录序列号分别为：DQ180375、DQ180387和DQ180359。分析结果显示在HCMV临床低传代D3、D2和D52病毒株UL138基因全序列841个碱基中，存在16个位点变异，可能编码的蛋白质氨基酸残基总数为169个，其基因序列高度保守，核苷酸变异均为碱基替换，无插入或缺失，碱基替换导致了7处氨基酸的改变。HCMVUL138蛋白翻译后修饰位点在除Toledo株外的所有分离株中均高度保守；所有分离株UL138蛋白的预测等电点均为6．51。结论广州地区感染婴儿的HCMVUL138基因及其编码的氨基酸序列极为保守，但仍具有一定的多态性，这在HCMV临床感染与致病机制研究中具有重要意义。

关键词：人巨细胞病毒临床病毒株 UL138 基因序列多态性

人巨细胞病毒临床分离株的鉴定及UL148基因分析

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中国妇幼保健 2012年第22期27卷 3486-3490页

作者：郭媛媛王波胡兢晶苏海浩丁俊彩谢斌华伍苑宾广州医学院附属广东省妇儿医院.广东省妇幼保健院儿科 510010

目的:研究广州地区先天性感染患儿体内人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株的鉴定及其UL148基因的序列特征分析。方法:收集广州地区感染HCMV的新生儿尿液标本,从中分离低传代临床病毒株,应用多重PCR方法鉴定,对其进行UL148基因全序列扩... 详细信息

目的:研究广州地区先天性感染患儿体内人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株的鉴定及其UL148基因的序列特征分析。方法:收集广州地区感染HCMV的新生儿尿液标本,从中分离低传代临床病毒株,应用多重PCR方法鉴定,对其进行UL148基因全序列扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果:成功分离出3株HCMV低传代病毒株(D2、D3、D52),经鉴定后的UL148基因序列被GenBank收录,序列号为:DQ180380,DQ180363和DQ180354。序列分析显示,3株临床分离株中UL148序列高度保守;在UL148全基因序列951个核苷酸中,所有变异均为碱基替换,无插入及缺失突变;编码蛋白由316个氨基酸残基组成,氨基酸序列也比较保守,各分离株中变异率为0.3%～1.9%;编码蛋白翻译后修饰位点包括细胞黏附相关的特征序列、PKC磷酸化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点等;其编码蛋白等电点为9.17～9.37。结论:广州地区HCMV UL148基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列极为保守,但仍具有一定的多态性,提示UL148 ORF可能是一个重要的功能基因。

关键词：人巨细胞病毒 UL148 临床病毒株序列分析

多重PCR方法鉴定人巨细胞病毒临床病毒分离株

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实用医学杂志 2011年第13期27卷 2312-2314页

作者：丁俊彩苏海浩胡兢晶郭媛媛谢斌华王波广州医学院附属广东省妇儿医院广东省妇幼保健院儿科510010

目的:应用多重PCR技术鉴定体外培养、分离获得的人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株。方法:以先天性感染HCMV的新生儿为研究对象,采集尿液标本进行病毒分离,将分离获得的临床低传代病毒感染HELF细胞,提取病毒DNA,针对较保守基因IE和LA,设计... 详细信息

目的:应用多重PCR技术鉴定体外培养、分离获得的人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株。方法:以先天性感染HCMV的新生儿为研究对象,采集尿液标本进行病毒分离,将分离获得的临床低传代病毒感染HELF细胞,提取病毒DNA,针对较保守基因IE和LA,设计两对引物,同时扩增IE和LA基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。结果:成功分离获得2株HCMV临床低传代病毒株(D2、D3),经多重PCR同时扩增出209bp(IE)和401bp(LA)目的片段。结论:多重PCR可以作为病毒分离后,基础研究中鉴定HCMV临床病毒株的一种方法。

关键词：巨细胞病毒多重PCR 临床病毒株病毒分离细胞病变效应