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世界华人消化杂志 2006年第22期14卷 2174-2179页

作者：刘明社王兰赵中夫张国英张芸封江南长治医学院肝病研究所山西省长治市046000 山西大学生命科学与技术学院山西省太原市030006 武汉市晶赛生物工程技术有限公司湖北省武汉市430074

目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对Fas的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)串联表达的栽体．方法:设计表达2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,构建重组质... 详细信息

目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对Fas的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)串联表达的栽体．方法:设计表达2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析．分别用SacI+ SalI双酶切重组质粒,胶回收酶切pEGFP6- 1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,T4 DNA Ligase连接酶切大、小片段,得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒．转化感受态细胞DH5α,扩增,提取串联重组质粒进行酶切鉴定．结果:成功构建靶向Fas的2个shRNA串联重组质粒载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2．酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功．结论:表达2个靶向Fas的shRNA表达框成功构建在一个重组质粒载体上．

关键词： Fas RNAi shRNA 串联质粒

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干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

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武汉大学学报（医学版） 2010年第4期31卷 426-429,434页

作者：马建鸿李世文罗仪武汉大学中南医院泌尿外科湖北武汉430071

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,... 详细信息

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。

关键词： HSP70-2 RNAi shRNA 串联质粒

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用于光增强型免疫联合治疗的可降解阳离子递送系统的研究

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作者：苏梦蕊北京化工大学

学位级别：硕士

在恶性肿瘤的治疗过程中,相较于采用单一治疗的方法,应用免疫联合治疗将会实现更高的疗效。其中光动力/免疫联合治疗是一种十分具有希望的策略。然而,传统的光动力/免疫联合治疗面临着递送制剂的异步性与联合递送不可避免的毒性影响与... 详细信息

在恶性肿瘤的治疗过程中,相较于采用单一治疗的方法,应用免疫联合治疗将会实现更高的疗效。其中光动力/免疫联合治疗是一种十分具有希望的策略。然而,传统的光动力/免疫联合治疗面临着递送制剂的异步性与联合递送不可避免的毒性影响与制剂失活的风险,限制了预期的治疗效果,如何最大化实现光动力/免疫联合治疗的效果仍是一个重大难题。通过多功能核酸的设计构建和导入,可以在同一靶细胞中独立表达多种功能蛋白,这种方法可以在恶性肿瘤的治疗中具有巨大的应用潜力。基于上述背景,在本论文中,我们通过设计多功能核酸的方法克服免疫联合治疗的问题,并通过多功能核酸递送系统的构建实现一种光增强型的免疫联合治疗策略。本论文第一章中,我们系统的阐述了针对恶性肿瘤的免疫治疗原理,总结了免疫联合治疗的策略应用在恶性肿瘤治疗的作用和贡献,同时提出了免疫联合治疗尤其是十分有希望的光动力/免疫联合治疗目前所面临的障碍。针对免疫联合治疗所述问题,介绍了核酸递送系统的基本设计思路,并对于目前多功能核酸的设计进行了概述,并提出了本论文研究思路。论文第二章,为了实现多功能核酸的成功递送,本课题利用简单温和的开环反应合成了三种可降解不同含氟量的聚阳离子核酸递送载体,分别为SS-HPT,SS-HPT-F63与SS-HPT-F108。其中SS-HPT-F108具有最小的细胞毒性,与最优异的细胞转染效率。进一步探究了双硫键与氟化烷基链的引入对于阳离子聚合物递送性能的影响。琼脂糖凝胶电泳实验证明三种聚合物能有效压缩p DNA,并在Na BH(10 m M)或过表达的谷胱甘肽(GSH)模拟体内还原环境的条件下无法实现对于p DNA的络合,证明材料中的双硫键将在肿瘤还原性环境中降解,同时有效释放p DNA,会提升递送载体的转染性能。同时通过流式细胞仪和激光共聚焦成像显示,SS-HPT-F108中氟含量的增加有效的促进了细胞对p DNA的内吞,进一步使用多种内吞抑制剂处理发现,氟化烷基链的引入会增加复合物多种内吞途径的可能性,并且高效快速完成p DNA的溶酶体逃逸,克服胞内运输的屏障,增强了细胞转染。这种可降解高效递送平台的设计也为后续功能性核酸实现免疫联合治疗奠定了基础。论文第三章,为了实现针对于恶性肿瘤的光动力/免疫联合治疗,我们构建了在同一靶细胞中可以同时独立表达两种蛋白的串联质粒p MIP-3β-KR(分别表达巨噬细胞炎症蛋白-3β与光敏蛋白Killer Red的质粒),与单一质粒p MIP-3β(仅表达巨噬细胞炎症蛋白-3β)和p KR(仅表达光敏蛋白Killer Red)。利用SS-HPT-F108将其递送至小鼠乳腺癌细胞(4T1)中,在成功释放治疗质粒后,完成蛋白的表达。在光照条件下,KR蛋白产生光动力治疗(PDT)的效果,并通过与内质网(ER)的共定位,实现ER的应激行为发生,进一步促进相关免疫细胞的活化与行为调节,且串联质粒的设计对于KR的独立表达与性能实现并不产生影响。上述串联质粒在实现同一个靶细胞表达多个功能蛋白的同时,进一步通过酶联免疫吸附试验测定发现KR蛋白的PDT作用效果进一步增强了免疫因子MIP-3β的外泌,由此在体内外实验中都呈现了SS-HPT-F108/p MIP-3β-KR+L组具有最优异的肿瘤细胞杀伤性能与免疫细胞调节能力,并对远端肿瘤的生长具有抑制作用,实现了一种光增强性免疫联合治疗方法。综上所述,我们设计了一种双功能串联质粒,采用多功能核酸递送系统的方法通过光动力/免疫联合治疗抗击恶性肿瘤,规避了在传统光动力/免疫联合治疗中,递送制剂的异步性与联合递送不可避免的毒性影响与制剂失活的问题,提供了多功能核酸递送系统的潜在应用。这种通过多功能核酸递送系统的优化设计与多功能质粒实现的增强型多模式治疗将提高单纯免疫联合治疗的效果,解决免疫联合治疗目前存在的问题,具有十分广阔的应用前景。

关键词：可降解高效递送载体氟化修饰串联质粒免疫组合疗法光增强

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