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生物转化厨余合成丰原素混菌系统构建

生物转化厨余合成丰原素混菌系统构建

作者：王晓凤天津大学

学位级别：硕士

厨余产量巨大且成分复杂，处理不当会造成严重的环境问题，甚至对人类健康造成威胁。但是，厨余含有丰富的有机物，具有很高的利用价值。进行厨余高值化的生物转化，符合国家环境友好和可持续发展的理念。本文针对厨余资源化利用问题，... 详细信息

厨余产量巨大且成分复杂，处理不当会造成严重的环境问题，甚至对人类健康造成威胁。但是，厨余含有丰富的有机物，具有很高的利用价值。进行厨余高值化的生物转化，符合国家环境友好和可持续发展的理念。本文针对厨余资源化利用问题，运用合成生物学策略构建了高效合成葡糖苷酶、淀粉酶和脂肪酶的毕赤酵母工程菌，构建与产脂肽解淀粉芽孢杆菌HM618混合培养系统，利用厨余生物转化合成丰原素（fengycin）研究。研究结果如下：　　构建的产淀粉酶工程菌（重组毕赤酵母GS115-amy98）最大酶活达到385.4U?mL-1，产葡糖苷酶工程菌GS115-α-glu53的最高酶活为247.3U?mL-1，而产脂肪酶工程菌GS115-lip2、GS115-α-lip2和GS115-lip7的脂肪酶活性没有显著差异，均达90.0U?mL-1左右。　　通过建立产酶工程菌和产脂肽HM618菌混菌系统利用厨余合成丰原素，结果表明，HM618和淀粉酶生产菌混合培养时，最高丰原素水平达15.0mg?L-1左右，是HM618纯培养的6.7倍;产脂肪酶工程菌与HM618混合培养时，丰原素最大产量仅为4.6mg?L-1;二菌混合培养的脂肽提取物对灰葡萄孢和立枯丝核菌的抑制效果均提高。但是，与HM618菌纯培养时相比，当HM618菌与产葡糖苷酶、淀粉酶、脂肪酶工程菌进行四菌混合培养时，其丰原素产量反而下降。经LC-MS分析表明，解淀粉芽孢杆菌HM618合成的丰原素组分复杂，包括C14-C18fengycinsA，C13-C14fengycinsB、C16-C18fengycinsB、C16fengycinB2和一些不饱和脂肪酸链的丰原素同系物。　　同时，构建了两个质粒（pJOE8999-dsrfAD和pJOE8999-dituD）用于敲除解淀粉芽孢杆菌HM618中与表面活性素和伊枯草菌素合成基因簇相关的srfAD和ituD基因，构建了3个拟加强HM618的淀粉酶基因表达的启动子整合质粒pMAD-P43、pMAD-Pveg和pMAD-C2up。　　上述研究表明，产淀粉酶和脂肪酶工程菌与解淀粉芽孢杆菌HM618混合培养可以促进厨余转化合成丰原素，研究工作为促进厨余的资源化利用提供了新策略。

关键词：厨余垃圾毕赤酵母解淀粉芽孢杆菌生物转化丰原素

木糖利用组合式模块转化丰原素人工细胞的构建

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木糖利用组合式模块转化丰原素人工细胞的构建

作者：高文婷天津大学

学位级别：硕士

木质纤维素是自然界最为丰富的且非粮食导向的可再生资源,木糖是木质纤维素三大组成成分之半纤维素的主要水解单糖,目前有关木质纤维素的转化一直存在瓶颈,而木糖的高效利用是解决该瓶颈的有效措施,丰原素是由芽孢杆菌类合成的一种具有... 详细信息

木质纤维素是自然界最为丰富的且非粮食导向的可再生资源,木糖是木质纤维素三大组成成分之半纤维素的主要水解单糖,目前有关木质纤维素的转化一直存在瓶颈,而木糖的高效利用是解决该瓶颈的有效措施,丰原素是由芽孢杆菌类合成的一种具有抑真菌、抑癌、细胞毒性功能的天然脂肽类抗生素,到目前,有关利用木糖合成丰原素的研究尚未报道。本文,主要以实验室保藏的引入调控蛋白sfp和调节因子degQ的Bacillus subtilis 168改造菌BSU00为底盘细胞,为提高木糖向丰原素合成的前体转化效率,设计引入木糖非磷酸化代谢Dahms途径功能模块,并针对Dahms途径的表达特性引入乙醇醛回补TCA循环模块以及XR-XDH模块进行代谢调控,使人工细胞在基本培养基中能够有效的转化木糖合成丰原素。首先进行非磷酸化木糖代谢Dahms模块(模块I)的制备与人工细胞的构建与表征。利用来自B.subtilis 168的强启动子P与来自Caulobacter crescentus的xyl B、xyl C和来自Escherichia coli的yjh G、yjh H完成Dahms的表达模块的制备,并先后构建了以质粒多拷贝形式进行表达的人工细胞BSU01和整合到基因组表达的人工细胞BSU02,通过分析对比M9培养基发酵的相关检测参数,以及丰原素的发酵结果,表明游离型以及整合型的单一Dahms模块人工细胞都存在不同程度的代谢压力,不利于丰原素的合成,因此需要在合成生物学的理性指导下再设计代谢模块调控Dahms途径不同模式下的表达。其次设计制备调控模块乙醇醛回补TCA模块(模块II)和XR-XDH模块(模块III),模块II分别与游离型Dahms模块表达人工细胞和整合型Dahms模块表达人工细胞BSU02组装得到双模块组合表达的人工细胞BSU03和BSU04。模块III与整合型Dahms模块表达人工细胞BSU02组装得到BSU05,通过M9培养基发酵中相关参数的变化表征乙醇醛回补TCA模块和XR-XDH模块的调控效果,同时进行丰原素的发酵,分析在调控模块与Dahms模块的组合表达人工细胞BSU03、BSU04、BSU05丰原素合成的变化。结果显示,BSU04木糖残糖量为0,且生长速率为0.27 h-1,乳酸含量为0.03 g/L,乙酸含量为0.59 g/L,丰原素的产量为50.28 mg/L,是确定的转化木糖合成丰原素的优质人工细胞。

关键词：枯草芽孢杆菌 Dahms模块乙醇醛回补TCA模块木糖丰原素

解淀粉芽孢杆菌BA-16-8所产脂肽丰原素对扩展青霉呼吸及营养利用的影响研究

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食品科技 2016年第11期41卷 8-14页

作者：付瑞敏陈五岭河南教育学院生命科学系郑州450046 西北大学生命科学学院西安710069

扩展青霉(Pennicilum expansum)是导致苹果采后青霉病的主要致病菌,为探讨Bacillus amyloliquefaciens BA-16-8所产生的脂肽类抗生素丰原素(Fengycin)对Penicillum expansum呼吸代谢、线粒体复合酶活性和营养物质利用的影响。通过溶氧... 详细信息

扩展青霉(Pennicilum expansum)是导致苹果采后青霉病的主要致病菌,为探讨Bacillus amyloliquefaciens BA-16-8所产生的脂肽类抗生素丰原素(Fengycin)对Penicillum expansum呼吸代谢、线粒体复合酶活性和营养物质利用的影响。通过溶氧量测定实验检测Fengycin处理对P.expansum的呼吸抑制率,通过线粒体酶活力测定实验检测Fengycin处理对P.expansum线粒体复合酶活力的影响,通过DNS比色法和双缩脲法测定Fengycin处理对P.expansum利用总糖和总蛋白的能力。结果表明,Fengycin主要抑制病原菌呼吸代谢的TCA途径。Fengycin是通过结合P.expansum线粒体复合酶II和III的相关基因,从而使该基因的表达受阻,进而影响线粒体酶的活性。随着Fengycin处理浓度的增加,P.expansum对总糖和总蛋白质的吸收及利用能力显著下降。研究结果表明,Fengycin的作用可影响P.expansum的呼吸,从而降低其代谢水平,最终抑制病原菌的生长。

关键词：解淀粉芽孢杆菌青霉病丰原素呼吸链

新型抗菌肽——表面活性素、伊枯草菌素和丰原素

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微生物与感染 2018年第1期13卷 56-64页

作者：金清肖明上海师范大学生命与环境科学学院上海200234

表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)是一类主要由革兰阳性芽胞杆菌通过非核糖体合成途径产生的抗菌肽,一般是由1个β-羟基脂肪酸与7~10个氨基酸肽链以酰胺键连接而成的环肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗... 详细信息

表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)是一类主要由革兰阳性芽胞杆菌通过非核糖体合成途径产生的抗菌肽,一般是由1个β-羟基脂肪酸与7~10个氨基酸肽链以酰胺键连接而成的环肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性,具有良好的医疗应用前景。目前,人们对这3种新型抗菌肽在医药领域中的研究进展所知甚少,故本文对其发现历史、结构特点、作用机制、生物合成和应用价值进行阐述,为后续研究提供借鉴。

关键词：抗菌肽表面活性素伊枯草菌素丰原素

Bacillus velenzensis S3-1基因组中表面活性素、伊枯草菌素和丰原素合成基因簇的定位与分析

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上海师范大学学报（自然科学版） 2018年第4期47卷 451-457页

作者：金清张蕾蒋秋悦苏翠珠肖明上海师范大学生命与环境科学学院上海200234 农业部都市农业重点实验室上海200240

通过Gen Bank数据库寻找能产生表面活性素、伊枯草菌素或丰原素并在基因组中其合成基因已得到注释的芽胞杆菌,经过BLAST比对序列初步确定这三类脂肽类抗菌肽的合成基因簇的位置,再运用anti SMASH进行其合成基因簇的最终定位.对表面活性... 详细信息

通过Gen Bank数据库寻找能产生表面活性素、伊枯草菌素或丰原素并在基因组中其合成基因已得到注释的芽胞杆菌,经过BLAST比对序列初步确定这三类脂肽类抗菌肽的合成基因簇的位置,再运用anti SMASH进行其合成基因簇的最终定位.对表面活性素、伊枯草菌素和丰原素的结构及相关的合成酶结构域进行了预测与分析.

关键词：生物信息学 Bacillus velezensis S3-1 表面活性素伊枯草菌素丰原素

解淀粉芽孢杆菌所产脂肽丰原素是防治苹果采后青霉病的关键物质

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江苏农业科学 2018年第3期46卷 80-85页

作者：付瑞敏常慧萍邢文会陈五岭河南教育学院生命科学系河南郑州450046 西北大学生命科学学院陕西西安710069

为构建解淀粉芽孢杆菌丰原素合成酶基因fenC缺失突变株,研究丰原素在苹果采后青霉病防治中所起的作用。根据同源重组的原理,采用PCR扩增fenC基因上、下游的同源序列,将其连接至穿梭质粒pMAD,构建含有壮观霉素抗性基因(spc)的同源重组质... 详细信息

为构建解淀粉芽孢杆菌丰原素合成酶基因fenC缺失突变株,研究丰原素在苹果采后青霉病防治中所起的作用。根据同源重组的原理,采用PCR扩增fenC基因上、下游的同源序列,将其连接至穿梭质粒pMAD,构建含有壮观霉素抗性基因(spc)的同源重组质粒pMAD-Δfen,通过电转化技术,将其转至解淀粉芽孢杆菌BA-16-8,通过抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选和高温培养筛选出解淀粉芽孢杆菌fenC基因敲除突变株BA-16-8-Δfen。通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,简称HPLC)分析、质谱鉴定和抑菌性试验检测敲除fenC基因对解淀粉芽孢杆菌防治青霉病的影响。结果表明,与野生株相比,突变株菌株细胞及其所产抗生素脂肽对扩展青霉的防治效果显著降低。说明丰原素在解淀粉芽孢杆菌BA-16-8防治青霉病中发挥主要作用。

关键词：解淀粉芽胞杆菌青霉病丰原素突变株同源重组扩展青霉菌

枯草芽胞杆菌HMB19198菌株抑菌物质的鉴定及其对番茄灰霉病的防治

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植物病理学报 2022年第2期52卷 247-255页

作者：郭庆港刘高鸽陈秀叶张晓云鹿秀云苏振贺及增发马平河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室保定071000 河北省农林科学院石家庄050031

设施番茄灰霉病发生频繁,易产生抗药性,利用微生物杀菌剂防治番茄灰霉病是切实可行且对环境友好的措施之一。本研究通过抑菌活性测定和田间棚室试验,获得一株有效防治番茄灰霉病的生防细菌HMB19198,通过16S rDNA联合gyrA、gyrB、rpoB和r... 详细信息

设施番茄灰霉病发生频繁,易产生抗药性,利用微生物杀菌剂防治番茄灰霉病是切实可行且对环境友好的措施之一。本研究通过抑菌活性测定和田间棚室试验,获得一株有效防治番茄灰霉病的生防细菌HMB19198,通过16S rDNA联合gyrA、gyrB、rpoB和rpoC等看家基因序列比对将菌株HMB19198鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果表明,菌株HMB19198的脂肽提取物对灰霉菌表现较强的抑菌活性,通过色谱分离技术结合质谱分析,证明菌株HMB19198主要产生脂肽类抗生素丰原素(fengycin)和表面活性素surfactin,其中fengycin包含fengycin A(C15-C18)和fengycin C(C19-C20)两种同系物。抑菌活性测定表明,fengycin对灰霉菌表现较强的抑菌活性,显微观察发现,fengycin处理后造成灰霉菌菌丝畸形。通过对菌株HMB19198全基因组序列进行分析,获得fengycin合成酶基因簇,从基因水平证明菌株HMB19198可以产生fengycin。

关键词：枯草芽胞杆菌灰霉菌丰原素生物防治

双孢菇内生枯草芽孢杆菌AB154中抑制人结肠癌Caco-2活性成分的发现及机理研究

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中国食品学报 2017年第12期17卷 26-34页

作者：刘灿生吉萍 David Yue Wei Lee 李小可尚小雅陈林申琳中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 美国哈佛大学医学院附属麦克林医院马萨诸塞州02478 中国人民大学农业与农村发展学院北京100872

在研究双孢菇的抗肿瘤活性成分时,发现其内生的一个枯草芽孢杆菌AB154的代谢产物,该产物具有较强的抑制人结肠癌Caco-2细胞活性。借助体外多种细胞毒活性跟踪测试,利用硫酸铵沉淀法和DEAESephadex阴离子交换柱层析,从枯草芽孢杆菌AB154... 详细信息

在研究双孢菇的抗肿瘤活性成分时,发现其内生的一个枯草芽孢杆菌AB154的代谢产物,该产物具有较强的抑制人结肠癌Caco-2细胞活性。借助体外多种细胞毒活性跟踪测试,利用硫酸铵沉淀法和DEAESephadex阴离子交换柱层析,从枯草芽孢杆菌AB154发酵液中分离得到抑制人结肠癌Caco-2细胞的活性组分,其IC50为109.94μg/m L,而对人正常支气管上皮细胞(NHBE)的抑制作用较弱。经高效液相色谱(HPLC)制备,结合MALDI-TOF MS、ESI-MS/MS分析和查阅文献,从活性组分中分离鉴定了2个亚组分表面活性肽(surfactin)和丰原素(fengycin)B1类脂肽,其抑制人结肠癌Caco-2细胞的IC_(50)依次为80.7μg/m L和312.5μg/m L。此研究首次发现fengycin B1类脂肽具有抑制人结肠癌Caco-2细胞的活性,机理研究发现fengycin B1在12 h时将细胞周期阻滞在G_0/G_1期,在24 h时阻滞在S期,同时能够损伤肿瘤细胞的细胞核。

关键词：双孢菇内生菌枯草芽孢杆菌丰原素人结肠癌Caco-2细胞

苏云金芽胞杆菌抗菌脂肽初步鉴定及抑菌活性测定

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微生物学杂志 2023年第1期43卷 57-65页

作者：荣哲吕凯旋王思佳金朝霞大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

植物枯萎病是影响作物生长的重要因素,利用植物内生菌拮抗病原菌生长,从而降低其危害程度是目前研究的热点。本研究从健康的番茄植株中筛选分离得到一株对番茄枯萎病病原菌有较强拮抗作用的内生细菌B-R1,通过形态学、生理生化以及分子... 详细信息

植物枯萎病是影响作物生长的重要因素,利用植物内生菌拮抗病原菌生长,从而降低其危害程度是目前研究的热点。本研究从健康的番茄植株中筛选分离得到一株对番茄枯萎病病原菌有较强拮抗作用的内生细菌B-R1,通过形态学、生理生化以及分子生物学检测分析,鉴定该菌株为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。为进一步探索该菌株的生防作用,首先将菌株发酵后离心,得到发酵上清液,采用盐酸沉淀法对其活性物质进行粗提,并检测其对大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌活性。通过薄层色谱法(TLC)、傅里叶红外光谱(FI-TR)、高分辨液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析并鉴定活性物质的结构。结果表明,苏云金芽胞杆菌对尖胞镰刀菌有良好的抑制作用,结构分析初步鉴定抗菌物质中含有丰原素(fengycin),属于脂肽类抗生素。

关键词：内生细菌苏云金芽胞杆菌抑菌活性丰原素脂肽类抗生素