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构建转化丰原素人工细胞及在代谢网络模型下基因改造

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构建转化丰原素人工细胞及在代谢网络模型下基因改造

作者：何明亮天津大学

学位级别：硕士

丰原素（Fengycin）是由芽孢杆菌发酵生产的一种由疏水的β-脂肪酸链和亲水的肽环两部分组成的化合物,具有十分显著的抗真菌活性。然而,野生型枯草芽孢杆菌168是不具备利用葡萄糖合成丰原素的能力。本文通过利用合成生物学方法创建了利... 详细信息

丰原素（Fengycin）是由芽孢杆菌发酵生产的一种由疏水的β-脂肪酸链和亲水的肽环两部分组成的化合物,具有十分显著的抗真菌活性。然而,野生型枯草芽孢杆菌168是不具备利用葡萄糖合成丰原素的能力。本文通过利用合成生物学方法创建了利用葡萄糖合成丰原素的人工细胞,并针对人工细胞构建了基因组尺度代谢网络模型,进行模型模拟预测指导下改造菌株提高丰原素产量。首先,为了获得稳定的枯草芽孢杆菌丰原素合成菌株,在本研究中构建了由枯草芽孢杆菌168的P43启动子基因、deg Q基因以及解淀粉芽孢杆菌FZB42的sfp基因组成的基因表达模块p HP13-P43-sfp-deg Q,经过对基因序列大小、方向等的测定验证了表达模块的正确性。然后将其导入枯草芽孢杆菌168原始菌株中构建了可以生产丰原素的枯草芽孢杆菌BSP000工程菌株。通过实验评估了工程菌株的稳定性,结果表明其是一株性能优质的细胞。在微氧条件下工程菌株BSP000的摇瓶产量达到26.44±1.98 mg/L丰原素。其次,从NCBI、KEGG等数据库中整理了枯草芽孢杆菌168的基因蛋白反应列表,经过手动精炼后,获得了BSP000菌株基因组尺度代谢网络模型。通过实验确定了菌株的比糖吸收速率和比丰原素合成速率并以之作为模型的约束条件,以菌株生物量作为目标函数,通过模拟计算出菌株最大比生长速率为0.1281 h,与实验测定的菌株最大比生长速率0.1216 h相比,误差在6%的范围内,说明模型的可信度是比较高的。与此同时将预测得出的靶点按照f 值进行排序分析,筛选出了靶基因acc A、cyp C以及gap A作为扩增靶点。最后,分别在菌株BSP000中过表达了acc A、cyp C和gap A基因。与初始菌株相比单过表达acc A、cyp C和gap A基因丰原素的产量分别增加了56.4%、46.6%和20.5%。为了进一步提高菌株丰原素的合成能力,对菌株BSP000进行了acc A和cyp C基因共表达以及acc A、cyp C和gap A基因共表达综合研究。acc A和cyp C基因共表达菌株BSP002丰原素产量达到53.38mg/L,提高了101.89%。通过同时共表达基因acc A、cyp C和gap A,重组菌株BSP003丰原素产量达到59.87 mg/L,是BSP000菌株丰原素产量的近2.3倍。

关键词：枯草芽孢杆菌168 丰原素人工细胞基因组尺度代谢模型基因改造

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生物转化厨余合成丰原素混菌系统构建

生物转化厨余合成丰原素混菌系统构建

作者：王晓凤天津大学

学位级别：硕士

厨余产量巨大且成分复杂,处理不当会造成严重的环境问题,甚至对人类健康造成威胁。但是,厨余含有丰富的有机物,具有很高的利用价值。进行厨余高值化的生物转化,符合国家环境友好和可持续发展的理念。本文针对厨余资源化利用问题,运用合... 详细信息

厨余产量巨大且成分复杂,处理不当会造成严重的环境问题,甚至对人类健康造成威胁。但是,厨余含有丰富的有机物,具有很高的利用价值。进行厨余高值化的生物转化,符合国家环境友好和可持续发展的理念。本文针对厨余资源化利用问题,运用合成生物学策略构建了高效合成葡糖苷酶、淀粉酶和脂肪酶的毕赤酵母工程菌,构建与产脂肽解淀粉芽孢杆菌HM618混合培养系统,利用厨余生物转化合成丰原素(fengycin)研究。研究结果如下:构建的产淀粉酶工程菌(重组毕赤酵母GS115-amy98)最大酶活达到385.4U·m L,产葡糖苷酶工程菌GS115-α-glu53的最高酶活为247.3 U·m L,而产脂肪酶工程菌GS115-lip2、GS115-α-lip2和GS115-lip7的脂肪酶活性没有显著差异,均达90.0 U·m L左右。通过建立产酶工程菌和产脂肽HM618菌混菌系统利用厨余合成丰原素,结果表明,HM618和淀粉酶生产菌混合培养时,最高丰原素水平达15.0 mg·L左右,是HM618纯培养的6.7倍;产脂肪酶工程菌与HM618混合培养时,丰原素最大产量仅为4.6 mg·L;二菌混合培养的脂肽提取物对灰葡萄孢和立枯丝核菌的抑制效果均提高。但是,与HM618菌纯培养时相比,当HM618菌与产葡糖苷酶、淀粉酶、脂肪酶工程菌进行四菌混合培养时,其丰原素产量反而下降。经LC-MS分析表明,解淀粉芽孢杆菌HM618合成的丰原素组分复杂,包括C14-C18 fengycins A,C13-C14 fengycins B、C16-C18 fengycins B、C16 fengycin B2和一些不饱和脂肪酸链的丰原素同系物。同时,构建了两个质粒(p JOE8999-dsrf AD和p JOE8999-ditu D)用于敲除解淀粉芽孢杆菌HM618中与表面活性素和伊枯草菌素合成基因簇相关的srf AD和itu D基因,构建了3个拟加强HM618的淀粉酶基因表达的启动子整合质粒p MAD-P43、p MAD-Pveg和p MAD-C2up。上述研究表明,产淀粉酶和脂肪酶工程菌与解淀粉芽孢杆菌HM618混合培养可以促进厨余转化合成丰原素,研究工作为促进厨余的资源化利用提供了新策略。

关键词：毕赤酵母解淀粉芽孢杆菌厨余丰原素混菌

枯草芽孢杆菌利用阿拉伯糖合成丰原素的理性代谢优化

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枯草芽孢杆菌利用阿拉伯糖合成丰原素的理性代谢优化

作者：靳佳琦天津大学

学位级别：硕士

丰原素是芽孢杆菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤及抗生物黏附等多种活性的两亲性环脂肽。本文主要通过氮源优化与理性代谢改造等策略,构建了能够利用阿拉伯糖高效生产丰原素的枯草芽孢杆菌优势工程菌株。为筛选阿拉伯糖作为发酵碳源时最适... 详细信息

丰原素是芽孢杆菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤及抗生物黏附等多种活性的两亲性环脂肽。本文主要通过氮源优化与理性代谢改造等策略,构建了能够利用阿拉伯糖高效生产丰原素的枯草芽孢杆菌优势工程菌株。为筛选阿拉伯糖作为发酵碳源时最适合生产丰原素的氮源,以实验室保藏的引入4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因sfp和多效调控因子基因deg Q的BSJ00作为初始菌株,探究了氮源对丰原素产量的影响。实验结果表明水溶性黄豆饼粉是最适合生产丰原素的氮源,所产生的丰原素是质荷比(m/z)为1463.8、1464.8、1477.8、1489.8、1491.8、1505.8、1506.8左右的混合物,最高丰原素的产量达到了121.20 mg/L。对丰原素生物合成基因簇的启动子进行替换改善了丰原素的生物合成。采用CRISPR-Cas9技术分别以P、P及P启动子替换BSJ00丰原素生物合成基因簇原有的启动子。结果表明P和P的替换均不利于丰原素的合成,而以P启动子替换的菌株BSJ02的丰原素产量比BSJ00增加了13.07%,达到137.05mg/L。进一步的相对荧光强度分析揭示了P启动子在枯草芽孢杆菌中时期依赖性的表达特点。脂肪酸作为丰原素合成的重要前体之一,通过脂肪酸通路的理性优化改善了丰原素的合成。在确定脂肪酸通路的单一改造对丰原素的合成具有正向作用后,探究了脂肪酸通路的组合改造对丰原素产量的影响。即以BSJ02作为出发菌株,通过敲除3-羟基酰基Co A脱水酶基因fad B、以P启动子过表达脂肪酸酰基Co A连接酶基因yhf L来强化脂酰Co A的供应,同时导入以P启动子过表达生物素羧化酶Ⅱ基因yng H、外源硫酯酶基因tes A的游离质粒表达盒来增强脂肪酸的合成。所构建的菌株BSJ023的最高丰原素产量达到了258.41 mg/L,丰原素的最终得率为0.013 g/g阿拉伯糖,是BSJ00的2倍。最后,qRT-PCR的结果表明BSJ023中编码丰原素生物合成基因簇与关键调控因子的相关基因相比于BSJ00显著上调了2.58～14.77倍。对立枯丝核菌和灰葡萄孢霉菌的抗真菌活性的分析揭示了BSJ023产生的丰原素具有稳定的理化性质和显著的抗真菌活性。

关键词：枯草芽孢杆菌168 丰原素启动子替换脂肪酸通路改造抗真菌活性

木糖利用组合式模块转化丰原素人工细胞的构建

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木糖利用组合式模块转化丰原素人工细胞的构建

作者：高文婷天津大学

学位级别：硕士

木质纤维素是自然界最为丰富的且非粮食导向的可再生资源,木糖是木质纤维素三大组成成分之半纤维素的主要水解单糖,目前有关木质纤维素的转化一直存在瓶颈,而木糖的高效利用是解决该瓶颈的有效措施,丰原素是由芽孢杆菌类合成的一种具有... 详细信息

木质纤维素是自然界最为丰富的且非粮食导向的可再生资源,木糖是木质纤维素三大组成成分之半纤维素的主要水解单糖,目前有关木质纤维素的转化一直存在瓶颈,而木糖的高效利用是解决该瓶颈的有效措施,丰原素是由芽孢杆菌类合成的一种具有抑真菌、抑癌、细胞毒性功能的天然脂肽类抗生素,到目前,有关利用木糖合成丰原素的研究尚未报道。本文,主要以实验室保藏的引入调控蛋白sfp和调节因子degQ的Bacillus subtilis 168改造菌BSU00为底盘细胞,为提高木糖向丰原素合成的前体转化效率,设计引入木糖非磷酸化代谢Dahms途径功能模块,并针对Dahms途径的表达特性引入乙醇醛回补TCA循环模块以及XR-XDH模块进行代谢调控,使人工细胞在基本培养基中能够有效的转化木糖合成丰原素。首先进行非磷酸化木糖代谢Dahms模块(模块I)的制备与人工细胞的构建与表征。利用来自*** 168的强启动子P与来自Caulobacter crescentus的xyl B、xyl C和来自Escherichia coli的yjh G、yjh H完成Dahms的表达模块的制备,并先后构建了以质粒多拷贝形式进行表达的人工细胞BSU01和整合到基因组表达的人工细胞BSU02,通过分析对比M9培养基发酵的相关检测参数,以及丰原素的发酵结果,表明游离型以及整合型的单一Dahms模块人工细胞都存在不同程度的代谢压力,不利于丰原素的合成,因此需要在合成生物学的理性指导下再设计代谢模块调控Dahms途径不同模式下的表达。其次设计制备调控模块乙醇醛回补TCA模块(模块II)和XR-XDH模块(模块III),模块II分别与游离型Dahms模块表达人工细胞和整合型Dahms模块表达人工细胞BSU02组装得到双模块组合表达的人工细胞BSU03和BSU04。模块III与整合型Dahms模块表达人工细胞BSU02组装得到BSU05,通过M9培养基发酵中相关参数的变化表征乙醇醛回补TCA模块和XR-XDH模块的调控效果,同时进行丰原素的发酵,分析在调控模块与Dahms模块的组合表达人工细胞BSU03、BSU04、BSU05丰原素合成的变化。结果显示,BSU04木糖残糖量为0,且生长速率为0.27 h-1,乳酸含量为0.03 g/L,乙酸含量为0.59 g/L,丰原素的产量为50.28 mg/L,是确定的转化木糖合成丰原素的优质人工细胞。

关键词：枯草芽孢杆菌 Dahms模块乙醇醛回补TCA模块木糖丰原素

木糖转化丰原素人工细胞构建及其代谢过程研究

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木糖转化丰原素人工细胞构建及其代谢过程研究

作者：谭维天津大学

学位级别：硕士

丰原素(fengycin)是一种新型脂肽类抗菌物质,目前对于丰原素合成及调节机制还知之甚少,如何将丰原素产量极低野生型菌株通过各种生物学方法的改造优化,解析合成调控机制和提升产量,对推动其研究和应用都有重要价值。本论文实现了丰原素... 详细信息

丰原素(fengycin)是一种新型脂肽类抗菌物质,目前对于丰原素合成及调节机制还知之甚少,如何将丰原素产量极低野生型菌株通过各种生物学方法的改造优化,解析合成调控机制和提升产量,对推动其研究和应用都有重要价值。本论文实现了丰原素从无到有的合成,提出了提升丰原素产量的可行性方法。第一方面,丰原素合成菌株的构建及强化:(1)以具有丰原素合成完整基因簇和高效蛋白合成分泌能力的枯草芽孢杆菌168为底盘细胞,由于其中4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因(sfp)发生了突变而不能完成非核糖体肽合成酶的活化,不具备催化活性。因此将由枯草芽孢杆菌强启动子P43与sfp以及调控外泌蛋白合成和分泌的调控因子基因degQ组成的非核糖体肽合成酶活化模块通过CRISPR技术整合至底盘细胞基因组,使枯草芽孢杆菌168具备了丰原素合成能力,完成了丰原素从无到有的合成过程。此时丰原素产量为10.43 mg/L,将构建的菌株命名为*** ds。(2)16-18个碳原子的β-羟基脂肪酸链是丰原素的主要结构组成部分,通过调节脂肪酸链的合成可提高如表面活性素其他脂肽类抗菌物质的合成,但对丰原素合成的影响尚无定论。因此,在B.中过表达了脂肪酸合成的限速途径丙二酰辅酶A合成途径的相关基因(acs、birA和accA CD),将丰原素产量提升为24.73 mg/L,提高至***的2.37倍,新构建的菌株命名为*** dspabacd。第二方面,培养基优化及丰原素合成主要影响代谢物的分析:(3)为研究***合成丰原素的最适条件,对***和*** dspabacd的发酵培养基类型和重要发酵条件进行了探究,对培养基类型、温度、转速、碳源等进行了优化。将*** ds中丰原素的产量提升为37.92 mg/L,提高至原来的3.64倍;*** dspabacd中丰原素的产量提升为130.11 mg/L,提高至原来的5.26倍。最高产量培养基为XMN培养基,发酵条件为30℃、180 r/min和5%的接种量。(4)通过代谢组学分析技术对*** ds和*** dspabacd在最优条件下的胞内代谢物情况进行了分析,证实了 accA CD、birA和acs是通过增大胞内脂肪酸合成量促进丰原素合成。另外还发现胞内丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等氨基酸对丰原素合成有重要的影响,为后续进一步提升丰原素的产量提供了理论指导。

关键词：丰原素人工细胞木糖培养基优化代谢组学

Bacillus velenzensis S3-1基因组中表面活性素、伊枯草菌素和丰原素合成基因簇的定位与分析

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上海师范大学学报（自然科学版） 2018年第4期47卷 451-457页

作者：金清张蕾蒋秋悦苏翠珠肖明上海师范大学生命与环境科学学院上海200234 农业部都市农业重点实验室上海200240

通过Gen Bank数据库寻找能产生表面活性素、伊枯草菌素或丰原素并在基因组中其合成基因已得到注释的芽胞杆菌,经过BLAST比对序列初步确定这三类脂肽类抗菌肽的合成基因簇的位置,再运用anti SMASH进行其合成基因簇的最终定位.对表面活性... 详细信息

通过Gen Bank数据库寻找能产生表面活性素、伊枯草菌素或丰原素并在基因组中其合成基因已得到注释的芽胞杆菌,经过BLAST比对序列初步确定这三类脂肽类抗菌肽的合成基因簇的位置,再运用anti SMASH进行其合成基因簇的最终定位.对表面活性素、伊枯草菌素和丰原素的结构及相关的合成酶结构域进行了预测与分析.

关键词：生物信息学 Bacillus velezensis S3-1 表面活性素伊枯草菌素丰原素

新型抗菌肽——表面活性素、伊枯草菌素和丰原素

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微生物与感染 2018年第1期13卷 56-64页

作者：金清肖明上海师范大学生命与环境科学学院上海200234

表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)是一类主要由革兰阳性芽胞杆菌通过非核糖体合成途径产生的抗菌肽,一般是由1个β-羟基脂肪酸与7~10个氨基酸肽链以酰胺键连接而成的环肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗... 详细信息

表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)是一类主要由革兰阳性芽胞杆菌通过非核糖体合成途径产生的抗菌肽,一般是由1个β-羟基脂肪酸与7~10个氨基酸肽链以酰胺键连接而成的环肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性,具有良好的医疗应用前景。目前,人们对这3种新型抗菌肽在医药领域中的研究进展所知甚少,故本文对其发现历史、结构特点、作用机制、生物合成和应用价值进行阐述,为后续研究提供借鉴。

关键词：抗菌肽表面活性素伊枯草菌素丰原素

解淀粉芽孢杆菌所产脂肽丰原素是防治苹果采后青霉病的关键物质

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江苏农业科学 2018年第3期46卷 80-85页

作者：付瑞敏常慧萍邢文会陈五岭河南教育学院生命科学系河南郑州450046 西北大学生命科学学院陕西西安710069

为构建解淀粉芽孢杆菌丰原素合成酶基因fenC缺失突变株,研究丰原素在苹果采后青霉病防治中所起的作用。根据同源重组的原理,采用PCR扩增fenC基因上、下游的同源序列,将其连接至穿梭质粒pMAD,构建含有壮观霉素抗性基因(spc)的同源重组质... 详细信息

为构建解淀粉芽孢杆菌丰原素合成酶基因fenC缺失突变株,研究丰原素在苹果采后青霉病防治中所起的作用。根据同源重组的原理,采用PCR扩增fenC基因上、下游的同源序列,将其连接至穿梭质粒pMAD,构建含有壮观霉素抗性基因(spc)的同源重组质粒pMAD-Δfen,通过电转化技术,将其转至解淀粉芽孢杆菌BA-16-8,通过抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选和高温培养筛选出解淀粉芽孢杆菌fenC基因敲除突变株BA-16-8-Δfen。通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,简称HPLC)分析、质谱鉴定和抑菌性试验检测敲除fenC基因对解淀粉芽孢杆菌防治青霉病的影响。结果表明,与野生株相比,突变株菌株细胞及其所产抗生素脂肽对扩展青霉的防治效果显著降低。说明丰原素在解淀粉芽孢杆菌BA-16-8防治青霉病中发挥主要作用。

关键词：解淀粉芽胞杆菌青霉病丰原素突变株同源重组扩展青霉菌

双孢菇内生枯草芽孢杆菌AB154中抑制人结肠癌Caco-2活性成分的发现及机理研究

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中国食品学报 2017年第12期17卷 26-34页

作者：刘灿生吉萍 David Yue Wei Lee 李小可尚小雅陈林申琳中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 美国哈佛大学医学院附属麦克林医院马萨诸塞州02478 中国人民大学农业与农村发展学院北京100872

在研究双孢菇的抗肿瘤活性成分时,发现其内生的一个枯草芽孢杆菌AB154的代谢产物,该产物具有较强的抑制人结肠癌Caco-2细胞活性。借助体外多种细胞毒活性跟踪测试,利用硫酸铵沉淀法和DEAESephadex阴离子交换柱层析,从枯草芽孢杆菌AB154... 详细信息

在研究双孢菇的抗肿瘤活性成分时,发现其内生的一个枯草芽孢杆菌AB154的代谢产物,该产物具有较强的抑制人结肠癌Caco-2细胞活性。借助体外多种细胞毒活性跟踪测试,利用硫酸铵沉淀法和DEAESephadex阴离子交换柱层析,从枯草芽孢杆菌AB154发酵液中分离得到抑制人结肠癌Caco-2细胞的活性组分,其IC50为109.94μg/m L,而对人正常支气管上皮细胞(NHBE)的抑制作用较弱。经高效液相色谱(HPLC)制备,结合MALDI-TOF MS、ESI-MS/MS分析和查阅文献,从活性组分中分离鉴定了2个亚组分表面活性肽(surfactin)和丰原素(fengycin)B1类脂肽,其抑制人结肠癌Caco-2细胞的IC_(50)依次为80.7μg/m L和312.5μg/m L。此研究首次发现fengycin B1类脂肽具有抑制人结肠癌Caco-2细胞的活性,机理研究发现fengycin B1在12 h时将细胞周期阻滞在G_0/G_1期,在24 h时阻滞在S期,同时能够损伤肿瘤细胞的细胞核。

关键词：双孢菇内生菌枯草芽孢杆菌丰原素人结肠癌Caco-2细胞