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中间普氏菌与粪肠球菌共生生物膜特性的初步研究

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中间普氏菌与粪肠球菌共生生物膜特性的初步研究

作者：侯梦瑶安徽医科大学

学位级别：硕士

1.背景与目的我们生活中常见的口腔疾病比如龋病、根尖周炎、牙髓炎、牙周病等等都是由于细菌的入侵、定植、感染而造成的。这些口内致病菌并非以浮游状态散落于口腔中,而是通过菌斑生物膜的形式长期黏附定植于牙面上、根尖区、根管内... 详细信息

1.背景与目的我们生活中常见的口腔疾病比如龋病、根尖周炎、牙髓炎、牙周病等等都是由于细菌的入侵、定植、感染而造成的。这些口内致病菌并非以浮游状态散落于口腔中,而是通过菌斑生物膜的形式长期黏附定植于牙面上、根尖区、根管内、牙周袋内。目前对于口内菌斑生物膜的研究报道日趋多见,这也成为近几年来研究口内致病菌的一个趋势。中间普氏菌（Prevotella intermedia）与粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是口内常见的致病厌氧菌。这两种细菌广泛存在于病变的根尖周组织内,是根尖周炎的主要致病菌之一。然而,现阶段对于这种共生生物膜的研究报道则很少看到。本实验希望通过对比这两种细菌单菌和共生环境中形成的生物膜,来研究该共生生物膜的部分特性,为根尖周炎的病因研究提供新的思路。2.方法2.1使用生物膜结晶紫染色技术对培养的生物膜样本染色,用酶标仪测定样本光密度值（OD值）2.2对培养的生物膜样本进行活死菌染色,用激光共聚焦扫描显微镜观察生物膜样本及其活死菌的分布。2.3通过RT-PCR和Real-Time RT-PCR技术对中间普氏菌和粪肠球菌的部分基因进行检测。3.结果3.1光密度值显示中间普氏菌生物膜的OD平均值最小,粪肠球菌生物膜的OD平均值其次,中间普氏菌与粪肠球菌共生生物膜OD平均值最大。3.2通过激光共聚焦显微镜对生物膜样本进行纵轴（Z轴）扫描,发现两种细菌共生生物膜最厚。两种细菌单独培养的生物膜较薄,且中间普氏菌的生物膜最薄。红色的死菌多分布在稀疏的生物膜底层,绿色的活菌较多分布在致密的生物膜上层。3.3相关基因的PCR结果。3.3.1 RT-PCR产物:中间普氏菌的ahpc,PIN17 A1058,clpb基因和粪肠球菌的gel E基因有较明显的单一亮带。两种细菌的内参均为16sr RNA。3.3.2 Real-Time RT-PCR产物分析得出Ct值。中间普氏菌的ahpc,clpb,PIN17A1058基因和粪肠球菌的gel E基因Ct值在双菌模板中比在单菌模板中小,并且中间普氏菌的基因Ct值差别更大。4.结论4.1细菌在共生生物膜中比在这两种细菌单独培养的生物膜中表现出了更强的成膜能力。4.2双菌共生生物膜中,与黏附成膜能力相关的ahpc,clpb,PIN17 A1058,gel E基因表达水平有所提高。4.3双菌共生生物膜对中间普氏菌的黏附特性有较大影响。

关键词：共生生物膜中间普氏菌粪肠球菌黏附成膜

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中间普氏菌在慢性牙周炎发病中的作用

实用口腔医学杂志 2010年第6期26卷 817-821页

作者：关素敏第四军医大学口腔医学院西安10032

对中间普氏菌在慢性牙周炎发病中的作用机制进行了综述。中间普氏菌通过向牙周组织黏附和定植、直接侵袭口腔组织细胞、促进炎性细胞因子的释放、干扰宿主免疫反应、促进骨吸收、抑制骨形成等作用而参与牙周炎的发生发展。

关键词：中间普氏菌慢性牙周炎发病机制

中间普氏菌特异性卵黄抗体治疗妊娠期龈炎的作用研究

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中间普氏菌特异性卵黄抗体治疗妊娠期龈炎的作用研究

作者：刘赟辽宁医学院

学位级别：硕士

目的制备妊娠期龈炎的主要致病菌中间普氏菌(Prevotella intermedia, Pi)的特异性卵黄抗体(IgY)，通过体外抑菌实验和动物实验考察特异性IgY的体外和体内抑菌活性。方法厌氧培养Pi，经甲醛灭活后免疫产蛋母鸡;采用水稀释和盐析法分... 详细信息

目的制备妊娠期龈炎的主要致病菌中间普氏菌(Prevotella intermedia, Pi)的特异性卵黄抗体(IgY)，通过体外抑菌实验和动物实验考察特异性IgY的体外和体内抑菌活性。方法厌氧培养Pi，经甲醛灭活后免疫产蛋母鸡;采用水稀释和盐析法分离特异性IgY;采用液体培养基比浊法考察不同浓度的特异性IgY对Pi的生长抑制活性;采用动物实验的方法考察特异性IgY对Pi的作用，将SD雌性大鼠随机分组，造成牙龈炎模型，分别测定各组大鼠牙龈指数(GI)、菌斑指数(PLI)、探诊出血(BOP)、血液白细胞计数(WBC)及体重(Weight)的变化，对各组大鼠进行牙龈组织病理切片检查，检查局部组织炎症变化。结果 1.特异性IgY对Pi具有生长抑制活性且呈剂量依赖性，浓度为20mg/ml能完全抑制Pi生长，与替硝唑无明显差别(p中间普氏菌特异性IgY对中间普氏菌有抑菌活性;2.中间普氏菌特异性IgY两种制剂(溶液和蛋黄粉)对中间普氏菌引起的牙龈炎均有治疗作用，溶液的治疗作用优于蛋黄粉。

关键词：卵黄抗体中间普氏菌妊娠期龈炎细菌抑制

抗中间普氏菌卵黄抗体对大鼠妊娠期龈炎疗效的初探

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口腔医学研究 2019年第5期35卷 466-470页

作者：蒋鹏徐燕周莉莉徐涵颖辛保见叶兴如沈继龙程婷安徽医科大学口腔医学院安徽医科大学附属口腔医院安徽省口腔疾病研究重点实验室安徽合肥230032 安徽医科大学人兽共患病安徽省重点实验室安徽合肥230032 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司安徽合肥230032

目的:制备和纯化抗中间普氏菌特异性卵黄免疫球蛋白(IgY),并评价其对实验性妊娠期大鼠牙龈炎的治疗作用。方法:两步硫酸铵沉淀法获得特异性IgY,将24只雌性SD大鼠随机分为4组,A组(空白组)、B组(阴性组):造模、C组:(阳性组)造模+替硝唑溶... 详细信息

目的:制备和纯化抗中间普氏菌特异性卵黄免疫球蛋白(IgY),并评价其对实验性妊娠期大鼠牙龈炎的治疗作用。方法:两步硫酸铵沉淀法获得特异性IgY,将24只雌性SD大鼠随机分为4组,A组(空白组)、B组(阴性组):造模、C组:(阳性组)造模+替硝唑溶液、D组:(实验组)造模+IgY溶液,通过牙龈指数(GI)、菌斑指数(PLI)、体重变化、RT-qPCR,及组织病理学切片观察特异性IgY的治疗作用。结果:通过对大鼠实验性妊娠期牙龈炎的治疗GI、PLI(P菌斑治疗前后中间普氏菌的构成比明显降低(P中间普氏菌特异性卵黄抗体可改善大鼠实验性妊娠期的牙龈炎症状况。

关键词：中间普氏菌牙龈炎实时荧光定量PCR

抗中间普氏菌卵黄抗体的制备及其对实验性妊娠期龈炎的预防作用

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安徽医科大学学报 2017年第8期52卷 1154-1159页

作者：王晓静徐燕孟明理程婷叶兴如庞罡周永敏周乐春沈继龙王荣海安徽医科大学口腔医学院合肥230032 安徽医科大学附属口腔医院安徽省口腔疾病研究中心实验室合肥230032 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司合肥230032 安徽医科大学人兽共患病安徽省重点实验室合肥230032

目的制备并纯化抗中间普氏菌卵黄抗体(抗P.intermedia-IgY),观察其对大鼠实验性妊娠期龈炎的预防作用。方法厌氧培养P.intermedia菌,2%甲醛灭活,以终浓度为1×109CFU/ml的P.intermedia菌,1 ml(0.5 ml菌液+0.5 ml佐剂)/次,免疫蛋鸡4次。... 详细信息

目的制备并纯化抗中间普氏菌卵黄抗体(抗P.intermedia-IgY),观察其对大鼠实验性妊娠期龈炎的预防作用。方法厌氧培养P.intermedia菌,2%甲醛灭活,以终浓度为1×109CFU/ml的P.intermedia菌,1 ml(0.5 ml菌液+0.5 ml佐剂)/次,免疫蛋鸡4次。用卵黄分离器去除蛋清,无菌注射器刺破卵黄膜,收集卵黄液,两步硫铵沉淀法纯化抗P.intermedia-IgY。SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot、ELISA对其分子量及特异性鉴定,并检测免疫后效价变化。将30只雌性SD大鼠,15只雄性SD大鼠,雌∶雄=2∶1,合笼获得24只孕鼠,随机分为4组:0.12%氯己定孵育组,抗P.intermedia-IgY孵育组,生理盐水孵育组,空白对照组,观察抗P.intermedia-IgY对实验性妊娠期龈炎的抑制作用。结果经4次免疫后抗体最高效价为1∶512 000,维持45 d。1 g卵黄经两步硫铵沉淀后得IgY约18 mg。SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后IgY纯度达64.5%。Western blot显示抗P.intermedia-IgY识别并特异性结合P.intermedia菌裂解片段。动物实验观察见0.12%氯己定孵育组及抗P.intermedia-IgY孵育组牙龈指数显著低于生理盐水孵育组(P<0.01),而两者之间牙龈指数差异无统计学意义。牙龈组织病理学观察显示抗P.intermedia-IgY孵育组牙龈的炎症状态轻于生理盐水孵育组。结论经4次免疫后可得到持续高效价的抗P.intermedia-IgY,且抗P.intermedia-IgY能够减轻大鼠实验性妊娠期龈炎的炎症状态,对大鼠实验性妊娠期龈炎有一定的预防作用。

关键词：中间普氏菌卵黄抗体妊娠期龈炎

中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞RANKL/OPG表达的影响

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口腔生物医学 2014年第2期5卷 75-77页

作者：杨迷芳杨天王子露王琰玲吴友农南京医科大学口腔医学研究所江苏南京210029

目的:探讨中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法:将系列浓度的中间普氏菌培养上清作用于牙龈成... 详细信息

目的:探讨中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法:将系列浓度的中间普氏菌培养上清作用于牙龈成纤维细胞,显微镜下观察细胞的变化。实时定量RT-PCR法和Western blot法分别检测RANKL、OPG mRNA及蛋白水平的表达,并计算RANKL/OPG的比值。结果:牙龈成纤维细胞的数量随中间普氏菌培养上清浓度的增加而减少,50μg/mL时,显微镜下没有活细胞存在。在mRNA水平上和蛋白水平上,RANKL/OPG的比值在12.5μg/mL处理组均高于对照组,差异具有统计学意义(P中间普氏菌培养上清可诱导人牙龈成纤维细胞表达RANKL和OPG,破坏RANKL/OPG比例的平衡,影响破骨细胞分化的细胞因子微环境,在破骨细胞分化和牙周炎骨吸收中起着一定的调节作用。

关键词：中间普氏菌牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体骨保护素

长春市某小学7～12岁儿童福赛斯坦氏菌和中间普氏菌分布状态调查

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中华口腔医学杂志 2011年第4期46卷 226-229页

作者：倪雪岩伊田博吕亚林铃木基之魏秀峰井上美津子首都医科大学附属北京安贞医院口腔医疗中心 100029 日本昭和大學齒學部小児齒科教室吉林大学口腔医学院病理科

目的应用聚合酶链反应（PCR）法对儿童口腔内福赛斯坦氏菌（Tannerella forsythus,Tf）和中间普氏菌（Prevotella intermedia,Pi）进行检测,探讨检出结果与牙周临床指标之间的关系.方法选取长春市自强小学151名7至12岁儿童为研究对象... 详细信息

目的应用聚合酶链反应（PCR）法对儿童口腔内福赛斯坦氏菌（Tannerella forsythus,Tf）和中间普氏菌（Prevotella intermedia,Pi）进行检测,探讨检出结果与牙周临床指标之间的关系.方法选取长春市自强小学151名7至12岁儿童为研究对象,选择右上颌中切牙和第一磨牙为被检牙位,取龈上菌斑、记录探诊出血（bleeding on probing,BOP）、探诊深度（probing depth,PD）、牙龈指数（gingival index,GI）,应用PCR法对儿童龈上菌斑中的Tf和Pi进行检测.结果儿童龈上菌斑中Tf、Pi的检出率分别为40.3%（1 18/293）、46.4%（136/293）;6颊面Tf、Pi的检出率分别为55.2%（80/145）、53.8%（78/145）均显著高于（1）唇面的Tf和Pi的检出率[分别为25.7%（38/148）、39.2%（58/148）],差异有统计学意义（P＜0.01）;Pi检出率随年龄增长呈逐渐减低趋势,Tf检出率在7～8岁组最高,其次为11～12岁和9～10岁组;BOP阳性部位的Tf、Pi检出率[分别为43%（35/81）、49%（40/81）]均高于BOP阴性部位二者的检出率[分别为37%（72/194）、45%（87/194）].在BOP阳性部位,随PD加深Tf检出率逐渐增高,特别是在PD 4 mm以上时Tf检出率明显增高（P＜0.01）,Tf检出率与BOP阳性、PD增加呈正相关.结论 7～12岁儿童龈上菌斑中高频度分布着Tf和Pi;上颌前牙区与磨牙区菌丛构成不同,Tf、Pi在磨牙区检出率更高,Tf的检出率与PD呈正相关,Tf检出率在7～8岁组最高,Pi检出率随年龄增长呈减低趋势,儿童时期进行牙周病早期预防是非常必要的.

关键词：聚合酶链反应儿童福赛斯坦氏菌中间普氏菌

抗中间普氏菌卵黄抗体对大鼠实验性妊娠期龈炎治疗作用的探究

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抗中间普氏菌卵黄抗体对大鼠实验性妊娠期龈炎治疗作用的探究

作者：蒋鹏安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:制备和纯化抗中间普氏菌特异性卵黄免疫球蛋白(Ig Y),并评价其对实验性妊娠期大鼠牙龈炎的治疗作用方法:两步硫酸铵沉淀法获得特异性Ig Y,将24只雌性SD大鼠随机分为4组,A组(空白组)、B组(阴性组):造模+生理盐水、C组:(阳性组)造模... 详细信息

目的:制备和纯化抗中间普氏菌特异性卵黄免疫球蛋白(Ig Y),并评价其对实验性妊娠期大鼠牙龈炎的治疗作用方法:两步硫酸铵沉淀法获得特异性Ig Y,将24只雌性SD大鼠随机分为4组,A组(空白组)、B组(阴性组):造模+生理盐水、C组:(阳性组)造模+替硝唑溶液、D组:(实验组)造模+Ig Y溶液,使用丝线结扎上下第一磨牙。饮用10%蔗糖水,接种细菌,结扎1周后与正常组同时按2∶1与雄鼠合笼,通过牙龈指数(GI)、菌斑指数(PLI)、体重变化、RT-q PCR检测治疗前后菌斑中中间普氏菌的构成比,及组织病理学切片观察特异性Ig Y的治疗作用。结果:通过对大鼠实验性妊娠期牙龈炎的治疗发现2.5mg/ml替硝唑组和Ig Y治疗组较生理盐水组的GI、PLI(P菌斑中替硝唑组和Ig Y组治疗前后中间普氏菌的构成比明显降低(P0.05)。牙龈组织病理学观察显示抗Ig Y组和替硝唑组牙龈的炎症状态轻于生理盐水组。结论:抗中间普氏菌特异性卵黄抗体可改善大鼠实验性妊娠期的牙龈炎症状况。

关键词：中间普氏菌牙龈炎 Taqman实时荧光定量PCR

抗中间普氏菌卵黄抗体的制备及其对实验性妊娠期龈炎的预防作用

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抗中间普氏菌卵黄抗体的制备及其对实验性妊娠期龈炎的预防作用

作者：王晓静安徽医科大学

学位级别：硕士

目的制备并纯化抗中间普氏菌卵黄抗体(抗P.intermedia-Ig Y),观察其对大鼠实验性妊娠期龈炎的预防作用。方法厌氧培养P.intermedia菌,2%甲醛灭活,以终浓度为1 x 109 CFU/m L的P.intermedia菌,1 m L(0.5 m L菌液+0.5 m L佐剂)/次,免疫蛋... 详细信息

目的制备并纯化抗中间普氏菌卵黄抗体(抗P.intermedia-Ig Y),观察其对大鼠实验性妊娠期龈炎的预防作用。方法厌氧培养P.intermedia菌,2%甲醛灭活,以终浓度为1 x 109 CFU/m L的P.intermedia菌,1 m L(0.5 m L菌液+0.5 m L佐剂)/次,免疫蛋鸡4次。用卵黄分离器去除蛋清,无菌注射器刺破卵黄膜,收集卵黄液,两步硫铵沉淀法纯化抗P.intermedia-Ig Y。SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot、ELISA对其分子量及特异性鉴定,并检测免疫后效价变化。将30只雌性SD大鼠(8-10周龄),15只雄性SD大鼠(8-10周龄),雌:雄=2:1合笼获得24只孕鼠,随机分为4组:0.12%氯己定孵育组(A),抗P.intermedia-Ig Y孵育组(B),生理盐水孵育组(C),空白组(D)。在造模期间,按分组情况接种经不同处理液孵育后的P.intermedia,1次/天,总共7次。通过检测各组之间牙龈指数(GI)、牙菌斑中P.intermedia含量差异及牙龈组织病理学检查,观察抗P.intermedia-Ig Y对实验性妊娠期龈炎的抑制作用。结果经4次免疫后抗体最高效价为1:512,000,维持45 d。1 g卵黄经两步硫铵沉淀后得Ig Y约18 mg。SDS-PAGE凝胶电泳显示纯化后Ig Y纯度达64.5%。Western blot显示抗P.intermedia-Ig Y识别并特异性结合P.intermedia菌裂解片段。动物实验观察见0.12%氯己定孵育组及抗P.intermedia-Ig Y孵育组牙龈指数(gingival index,GI)显著低于生理盐水孵育组(P0.05)。牙龈组织病理学观察显示抗P.intermedia-Ig Y孵育组牙龈的炎症状态轻于生理盐水孵育组。结论经4次免疫后可得到持续高效价的抗P.intermedia-Ig Y,且抗P.intermedia-Ig Y能够减轻大鼠实验性妊娠期龈炎的炎症状态,对大鼠实验性妊娠期龈炎有一定的预防作用。

关键词：中间普氏菌卵黄抗体妊娠期龈炎预防