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中药水提物对链霉菌次生代谢物生物合成的调控研究

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中药水提物对链霉菌次生代谢物生物合成的调控研究

作者：聂智英天津中医药大学

学位级别：硕士

近年来,由于抗生素的滥用而导致多重耐药的“超级细菌”的出现严重威胁到了全人类的健康,因此对于结构新颖和作用机制独特的新型抗生素的需求迫在眉睫。大黄、虎杖、杜仲、金银花和板蓝根等中草药不仅能通过抑制人体内病原体的繁殖来治... 详细信息

近年来,由于抗生素的滥用而导致多重耐药的“超级细菌”的出现严重威胁到了全人类的健康,因此对于结构新颖和作用机制独特的新型抗生素的需求迫在眉睫。大黄、虎杖、杜仲、金银花和板蓝根等中草药不仅能通过抑制人体内病原体的繁殖来治疗感染性疾病,还能够促进人体内肠道益生菌的生长。研究表明中药中某些小分子活性化合物可以作为激发子,对微生物次级代谢产物的生物合成途径起到激活作用。微生物次级代谢产物提供了抗生素化合物的丰富来源,其中核糖体合成和翻译后修饰肽（ribosomal synthesis and post-translation modification peptides,RiPPs）显示出强大的抗生素活性,羊毛硫肽作为RiPPs家族中的重要成员之一,因其独特的结构与抑菌机制而倍受关注。链霉菌的次级代谢产物早已被认为是微生物药物天然产物的分子宝库,是药物先导化合物的重要来源,基因组挖掘表明链霉菌生产羊毛硫肽的潜力巨大,但在常规培养条件下有大量的基因簇处于“沉默”或者低表达的状态。因此,激活链霉菌中羊毛硫肽基因簇的研究是必要的。中药及其有效成分能够调控微生物次级代谢产物的生产与活性,但其作用机尚不清楚。因此研究中药对微生物次级代谢物的调控机制不仅有助于开发出更多新型活性化合物,而且能为研究小分子化合物激活微生物中沉默基因簇的作用机制提供理论依据。本论文研究内容主要分为三部分,首先从细菌基因组数据库中选取具有益生潜力的基因组,采用各种生物信息学方法进行次级代谢产物的生物合成基因簇（Biosynthetic gene clusters,BGCs）的挖掘、RiPPs分类和分析,绘制细菌RiPPs的BGCs谱。其次选取杜仲叶、大黄和虎杖的水提物为研究对象,以含有沉默RiPPs的BGCs的链霉菌菌株为例,采用中药与细菌共培养的方法研究中药是否具有激活“沉默的”RiPPs的BGCs的能力。最后以链霉菌CB02414中的一个I型羊毛硫肽生物合成基因簇作为研究对象对其进行了基因调控,包括利用异源表达、双向启动子的替换、基因敲除策略,探究中药水提物激活该基因簇的机制。具体研究内容及研究结果如下:1.羊毛硫肽的基因组挖掘与生物合成分析本文利用antiSMASH 5.0、BAGEL 3和RiPPMiner等在线生物信息学软件分别对195株细菌的基因组进行次级代谢物的挖掘,并对挖掘到的多种RiPPs的类型及其生物合成基因簇进行归类与分析,重点对挖掘到的羊毛硫肽的生物合成基因簇进行了前体肽的多序列对比以及生物合成基因的分析。研究结果表明,新一代益生菌（NGPs）包括拟杆菌属、栖粪杆菌属、厌氧丁酸菌属、普雷沃氏菌属、克里斯滕森菌属、梭菌属和阿克曼氏菌属共7个菌属,在这7个属的161株菌基因组中挖掘到的RiPPs类化合物的类型丰富但数量较少,仅在6株NGPs中发现了5个I型羊毛硫肽和一个Ⅱ型羊毛硫肽的BGCs。对比antiSMASH 5.0和BAGEL 3两个软件的预测数量与类型,发现链霉菌中羊毛硫肽不仅类型丰富而且基因簇数量多,在34株链霉菌中使用antiSMASH 5.0预测到了132个羊毛硫肽的BGCs,其中Ⅲ型羊毛硫肽占比最多,Ⅴ型占比最少。对链霉菌CB02414中的一个I型羊毛硫肽的BGC进行具体分析,预测其完整的生物合成途径和可能的翻译后修饰结构,因此选择了对链霉菌进行中药水提物干预。2.中药水提物对链霉菌次生代谢物生产的影响选取杜仲叶水提物、大黄水提物和虎杖水提物作为待测试中药,采用中药提取物分别与链霉菌（Streptomyces ***02414;Streptomyces ***03234;Streptomyces ***02130和Streptomyces *** S-1813）共培养发酵的方法,将中药水提物按不同浓度比例加至液体培养基中与链霉菌共发酵七天后进行发酵产物的提取,通过高效液相色谱和液相-质谱联用技术对四株链霉菌的次级代谢产物差异性进行分析,并采用药敏片扩散法测定发酵液粗体物的抑菌活性。研究结果表明,在中药水提物的干预下四株链霉菌的代谢物对大肠杆菌没有抑制作用,而对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌具有明显的抑制作用。与不加中药干预组相比,大黄水提物和虎杖水提物对四株链霉菌发酵液的粗提物的差异并不显著,但共培养的发酵产物有微弱的抑菌活性。杜仲叶水提物可显著促进链霉菌的次级代谢产生新的化合物,并且能促进其代谢物的抗菌活性。3.中药水提物促进链霉菌CB02414产Planosporicin-like的调控机制研究在第一章中通过基因组挖掘发现了链霉菌CB02414中存在一个潜在的I型羊毛硫抗生素（Planosporicin-like）的前体肽合成基因,但研究发现该菌的发酵液对藤黄微球菌的抑菌活性较弱。虽然杜仲叶水提物具有促进链霉菌代谢

关键词：羊毛硫肽核糖体合成和翻译后修饰肽生物合成基因簇新一代益生菌中药水提物

中药水提物对猪源耐四环素大肠杆菌的抑制活性

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中国农业科学 2013年第11期46卷 2370-2376页

作者：黄名钱孔祥峰肖莉春郭小权江西农业大学动物科学技术学院中国科学院亚热带农业生态研究所/湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心

【目的】了解中药水提物对猪源耐四环素大肠杆菌的抑制活性,为其在养猪生产中的应用提供依据。【方法】纸片法测定10个猪源大肠杆菌分离株对四环素的敏感性,PCR方法测定其对四环素耐药基因的携带情况;琼脂扩散法和微量倍比稀释法测定中... 详细信息

【目的】了解中药水提物对猪源耐四环素大肠杆菌的抑制活性,为其在养猪生产中的应用提供依据。【方法】纸片法测定10个猪源大肠杆菌分离株对四环素的敏感性,PCR方法测定其对四环素耐药基因的携带情况;琼脂扩散法和微量倍比稀释法测定中药水提物及其与四环素的混合物对10个猪源大肠杆菌分离株的抑制活性。【结果】10个受试菌株对四环素的耐药率达100%,部分或全部菌株携带tetA(10/10)、tetB(2/10)和tetC(9/10)等四环素耐药基因;山楂、五味子、连翘和金银花的水提物均有较强的抑菌活性,但与四环素混合后,其抑菌圈直径减小,最小抑菌浓度增大。【结论】受试菌株对四环素的耐药性可能由tetA、tetB和tetC等四环素耐药基因引起,测定的4种中药水提物对受试菌株均有抑制活性,但不宜与四环素联用。

关键词：大肠杆菌中药水提物四环素耐药性

低毒中药抑菌“大作战”——5种低毒中药水提物对大肠杆菌的抑制作用

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发明与创新（高中生） 2022年第5期 28-31页

作者：曾信瑶侯佩彤李沅蔚广州市南武中学

本期点评专家张永强中学高级教师,湖南省十佳科技教师。科普中国2021年度十大科普人物奖获得者,全国校园发明创意大赛、湖南省青少年科技创新大赛、湖南省创新编程与智能设计大赛、湖南省科学调查体验活动评审专家组成员。细菌耐药性已... 详细信息

本期点评专家张永强中学高级教师,湖南省十佳科技教师。科普中国2021年度十大科普人物奖获得者,全国校园发明创意大赛、湖南省青少年科技创新大赛、湖南省创新编程与智能设计大赛、湖南省科学调查体验活动评审专家组成员。细菌耐药性已成为全球医学界关注的问题。由于耐药菌株的出现,抗生素对细菌的抑制作用逐渐减小,寻找抗生素的替代品迫在眉睫。中药作为中华5000年文明的结晶,是一座价值不可估量的宝库,具有作用靶位多、不易产生耐药性等诸多优点。因此,从我国低毒中药中筛选细菌抑制剂是解决这一难题的有效途径之一。

关键词：体验活动中学高级教师智能设计创意大赛科普中药水提物评审专家组细菌耐药性

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5种中药水提物对大肠杆菌体外生物被膜形成的影响

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中兽医医药杂志 2023年第6期42卷 12-15页

作者：王巧玉甄明哲张年洁吴晓航郭薪淼王新黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

探索黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜形成的影响。采用试管二倍稀释法测定5种中药水提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC),通过银染法观察5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜黏附作用的影响,采用结晶紫... 详细信息

探索黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜形成的影响。采用试管二倍稀释法测定5种中药水提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC),通过银染法观察5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜黏附作用的影响,采用结晶紫染色法检测5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制作用。结果显示,黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英等水提物对大肠杆菌的MIC分别为500 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、250 mg/mL和125 mg/mL。通过镜像图可观察到对照组中有大面积的黑斑,而5种用药组的黑斑面积明显减小。对照组的大肠杆菌生物被膜洗脱液OD值为0.555,黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英等用药组的生物被膜洗脱液OD值分别为0.245、0.236、0.237、0.213和0.229,与对照组比较差异极显著(P中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制率分别为55.9%、57.3%、57.5%、61.6%和58.7%。结果表明,5种中药水提物均能有效抑制大肠杆菌生物被膜的形成。

关键词：中药水提物细菌生物被膜大肠杆菌

中药水提物对痤疮丙酸杆菌体外抑制作用及对兔耳痤疮模型的疗效研究

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中药水提物对痤疮丙酸杆菌体外抑制作用及对兔耳痤疮模型的疗效研...

作者：廖恒利泸州医学院

学位级别：硕士

目的：分别提取十九种中药的水提物，观察其对痤疮丙酸杆菌标准株及临床株的体外抑制作用，从中筛选出对痤疮丙酸杆菌具有体外抑制作用的中药水提物，并将筛选出的药物外用于兔耳痤疮模型进行疗效及不良反应观察，从而为今后临床上痤疮... 详细信息

目的：分别提取十九种中药的水提物，观察其对痤疮丙酸杆菌标准株及临床株的体外抑制作用，从中筛选出对痤疮丙酸杆菌具有体外抑制作用的中药水提物，并将筛选出的药物外用于兔耳痤疮模型进行疗效及不良反应观察，从而为今后临床上痤疮的治疗提供一些新的可供选择的药物。方法：1．采集痤疮患者皮损内容物，37°C厌氧培养48小时后，采用耐氧实验、革兰氏染色镜检、触媒实验、硝酸盐实验、糖发酵实验等系列生化实验以及ANI厌氧菌鉴定卡，VITEK全自动微生物鉴定仪鉴定为痤疮丙酸杆菌。2．经查阅文献[3-4]后选择临床上使用频率较高的19种中药（黄柏、黄芩、大黄、金银花、苦参、连翘、地肤子、白头翁、百花蛇舌草、鱼腥草、马齿苋、旱莲草、紫草、板蓝根、大青叶、蒲公英、车前子、白芷、蛇床子）各20g，分别加水浸泡、煎煮、过滤、浓缩配制成20ml(相当于原药浓度1g/ml)的中药水提物。3．配制含不同浓度的19种中药水提物的改良GAM培养平板，以琼脂稀释法检测各种药物的MIC，筛选出对痤疮丙酸杆菌有体外抑菌作用的中药水提物;同时检测临床上治疗痤疮常用的4种抗生素的MIC，以了解痤疮丙酸杆菌的耐药情况。4．选取健康雄性家兔（普通级）7只，采用Kligman法造模，将煤焦油外涂于兔耳的双侧耳管开口2cm×2cm处，每日1次，连续2周，于造模第7天时皮下注射痤疮丙酸杆菌菌悬液，浓度为1.0×108CFU/ml，每侧约50ul。造模成功后以随机分组方式将14只兔耳分为7组，每组2只，其中6组擦拭中药水提物，第7组1只兔耳擦拭夫西地酸乳膏，另1只擦拭生理盐水进行对照，每日1次，分别于第7天、第14天、第21天观察其疗效及不良反应。结果：1．从80例痤疮患者皮损处分离培养并鉴定出痤疮丙酸杆菌27例，阳性率为33.75%，性别、年龄无统计学差异。2．黄柏、黄芩、大黄的MIC为25mg/ml;金银花、苦参的MIC为50mg/ml;连翘的MIC为100mg/ml;地肤子、白头翁、百花蛇舌草、鱼腥草、马齿苋、旱莲草、紫草、板蓝根、大青叶、蒲公英、车前子、白芷、蛇床子13味中药在最高浓度200mg/ml进行测试时仍未产生抑菌作用。3．甲硝唑MIC50为16μg/ml，MIC90为128μg/ml，耐药率为78.57%。克林霉素MIC50为4μg/ml， MIC90为16μg/ml，耐药率为28.57%。阿奇霉素MIC50为2μg/ml，MIC90为8μg/ml，耐药率为21.42%。罗红霉素MIC50为1μg/ml，MIC90为64μg/ml，耐药率为46.42%。4．兔耳在涂煤焦油7天后，局部增厚，变硬，毛孔变粗大，毛囊口增大并开放隆起，可见白色粉刺及黑色角栓。第14天时可见红色炎性丘疹及少许脓疱。5．经分别擦拭黄柏、黄芩、大黄、金银花、苦参、连翘六种中药水提物治疗7天后的兔耳红肿减轻，部分消退，14天后兔耳厚度变薄，柔软度有所增加，21天后局部毛囊口角栓及丘疹、粉刺减少变平。未见红斑、脱屑等不良反应;外用夫西地酸乳膏治疗后的兔耳红肿消退，而擦拭生理盐水的兔耳与治疗前相比未见明显变化。结论：1．黄柏、黄芩、大黄、金银花、连翘、苦参六种中药水提物对痤疮丙酸杆菌具有良好的体外抑制作用。2．痤疮丙酸杆菌对甲硝唑、克林霉素、罗红霉素、阿奇霉素四种抗生素均有不同程度的耐药，其中甲硝唑耐药率最高。3.黄柏、黄芩、大黄、金银花、连翘、苦参六种中药水提物对实验兔耳痤疮模型有治疗作用。4．外用黄柏、黄芩、大黄、金银花、连翘、苦参六种中药水提物治疗兔耳痤疮模型未观察到明显的不良反应。

关键词：痤疮丙酸杆菌中药水提物琼脂稀释法痤疮模型

不同中药水提物对孤苓核生柄孔菌发酵产胞内三萜类物质和胞外多糖的影响

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菌物学报 2017年第12期36卷 1667-1673页

作者：马燕余晓斌江南大学生物工程学院江苏无锡214122

将11种中药水提物分别加入孤苓核生柄孔菌液体发酵中,以生物量、胞外多糖和三萜类物质为指标,从中选出最佳中药、最佳中药浓度以及最佳中药浓度组合。结果表明,对孤苓核生柄孔菌生长与发酵产物影响最大的中药是何首乌和菊花2种。菊花对... 详细信息

将11种中药水提物分别加入孤苓核生柄孔菌液体发酵中,以生物量、胞外多糖和三萜类物质为指标,从中选出最佳中药、最佳中药浓度以及最佳中药浓度组合。结果表明,对孤苓核生柄孔菌生长与发酵产物影响最大的中药是何首乌和菊花2种。菊花对三萜类物质的影响较大,何首乌则对孤苓核生柄孔菌生长和发酵胞外多糖影响较大。孤苓核生柄孔菌发酵生物量达到最大(23.97g/L)的条件为添加何首乌水提物浓度15g/L;产胞外多糖的最佳(4.15g/L)条件为添加何首乌水提物浓度5g/L;总三萜类物质产量达到最高值(397.99mg/L)的条件为组合中药水提物:何首乌和菊花水提物浓度均为25g/L。

关键词：孤苓核生柄孔菌三萜类物质胞外多糖生物量中药水提物

三味补益类中药水提物对鸡肠道形态结构和免疫功能的影响

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黑龙江畜牧兽医 2021年第4期 110-115,158页

作者：梁小瑞贾诚王丹阳孙国杰邵永斌谷新利罗燕石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

为了研究三味补益类中药(黄芪、党参、山药)对鸡肠道形态结构和免疫功能的影响,试验将100只1日龄雄性麻黄鸡分成5组,每组20只,空白组腹腔注射生理盐水,模型组和中药组于15~17日龄腹腔注射大肠杆菌O78。各中药组在第18日龄开始饮用中药... 详细信息

为了研究三味补益类中药(黄芪、党参、山药)对鸡肠道形态结构和免疫功能的影响,试验将100只1日龄雄性麻黄鸡分成5组,每组20只,空白组腹腔注射生理盐水,模型组和中药组于15~17日龄腹腔注射大肠杆菌O78。各中药组在第18日龄开始饮用中药水提物,连用7 d。在25日龄和32日龄,每组选取6只鸡进行采血,采集小肠肠段,计算肠道系数,制作病理组织切片观察肠黏膜形态结构,检测免疫器官指数、血清免疫球蛋白、总蛋白和白蛋白含量及新城疫病毒IgG抗体效价,探究黄芪、党参和山药水提物对小肠黏膜形态结构和免疫功能的影响。结果表明:模型组的十二指肠、空肠和回肠绒毛断裂,上皮细胞脱落;而中药组和空白组的十二指肠、空肠和回肠黏膜均有所改善。25日龄时,黄芪组和党参组回肠长度系数均显著高于模型组(P<0.05);党参组十二指肠绒毛高度显著高于模型组(P<0.05),党参组和山药组十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著高于模型组(P<0.05);黄芪组和山药组空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均显著高于模型组(P<0.05);黄芪组胸腺指数显著高于模型组(P<0.05),党参组法氏囊指数显著高于模型组(P<0.05);与模型组比,黄芪组、党参组和山药组血清IgA和IgM含量均显著升高(P<0.05),党参组和山药组血清NDV-IgG含量,以及血清白蛋白和总蛋白含量均显著升高(P<0.05)。32日龄时,山药组十二指肠长度系数显著高于模型组(P<0.05);黄芪组、党参组和山药组十二指肠和空肠绒毛高度均显著高于模型组(P<0.05),黄芪组、党参组和山药组空肠绒毛高度/隐窝深度均显著高于模型组(P<0.05);党参组和山药组回肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度均显著高于模型组(P<0.05);黄芪组和山药组脾脏指数均显著高于模型组(P<0.05),黄芪组法氏囊指数显著高于模型组(P<0.05);黄芪组、党参组和山药组血清IgA和IgM含量均显著高于模型组(P<0.05),党参组和山药组血清NDV-IgG含量均显著高于模型组(P<0.05)。与模型组比,党参组和山药组血清白蛋白和总蛋白含量均显著升高(P<0.05)。说明黄芪、党参和山药有助于促进肠道发育及保持肠道形态结构完整,显著提升机体免疫能力。

关键词：中药水提物补益类中药肠道结构免疫功能免疫球蛋白

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4种中药水提物的体外止血效果比较

中国药房 2015年第10期26卷 1339-1342页

作者：李玲廖丹葵赵钟兴林钻煌覃青云许静伍善广孙建华黄光伟广西大学化学化工学院南宁530004 柳州两面针股份有限公司广西柳州545001

目的:研究三七、白芨、蒲黄、仙鹤草水提物体外止血效果,并进行比较。方法:以内部沸腾法制备上述4种中药水提物。试验分为空白对照(等容生理盐水)组与三七、白芨、蒲黄、仙鹤草水提物(10 mg/ml)组,采用纤维蛋白原平板法测定凝血酶活性... 详细信息

目的:研究三七、白芨、蒲黄、仙鹤草水提物体外止血效果,并进行比较。方法:以内部沸腾法制备上述4种中药水提物。试验分为空白对照(等容生理盐水)组与三七、白芨、蒲黄、仙鹤草水提物(10 mg/ml)组,采用纤维蛋白原平板法测定凝血酶活性以绘制标准曲线,测量反应的溶圈面积及计算凝血酶活性促进率。取家兔血浆随机均分为正常对照(等容生理盐水)组、云南白药(3.3 mg/ml)组与三七、白芨、蒲黄、仙鹤草水提物(3.3 mg/ml)组,测定家兔血浆复钙时间、血小板黏附率、血小板聚集率。结果:与空白对照组比较,三七水提物组溶圈面积增大,凝血酶活性促进率升高;白芨、蒲黄、仙鹤草水提物组溶圈面积减小,凝血酶活性促进率降低,差异均有统计学意义(P水提物组家兔血浆复钙时间缩短,仙鹤草水提物组家兔血浆复钙时间延长;三七、白芨水提物组家兔血小板黏附率、血小板聚集率升高,蒲黄、仙鹤草水提物组家兔血小板黏附率、血小板聚集率降低,差异均有统计学意义(P中药水提物中,三七水提物的体外止血效果最显著。

关键词：中药水提物三七止血凝血酶活性家兔血浆

不同中药水提物对蝉拟青霉液体深层发酵和产物活性的影响

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食品工业科技 2015年第3期36卷 168-171,177页

作者：韦朝阳贺亮李卫旗邵双双冯依力程俊文浙江大学生命科学学院浙江杭州310058 浙江省林业科学研究院生物技术所浙江杭州310023 浙江大学医学院附属邵逸夫医院浙江杭州310016

通过分别向培养基中添加不同的中药水提物进行蝉拟青霉液体发酵培养,探究其对蝉拟青霉发酵过程中生物量、胞外和胞内多糖的产量及其产物活性的影响。结果表明,黄芪、薏苡仁、枸杞的水提物分别对蝉拟青霉生物量、胞外和胞内多糖的合成促... 详细信息

通过分别向培养基中添加不同的中药水提物进行蝉拟青霉液体发酵培养,探究其对蝉拟青霉发酵过程中生物量、胞外和胞内多糖的产量及其产物活性的影响。结果表明,黄芪、薏苡仁、枸杞的水提物分别对蝉拟青霉生物量、胞外和胞内多糖的合成促进效果最为显著(p水提物不利于蝉拟青霉的发酵培养;对于产物活性,结果显示枸杞水提物能同时显著(p水提物是蝉拟青霉液体发酵的最适中药成分,其最佳添加量为10g/L。

关键词：蝉拟青霉液体发酵中药水提物真菌多糖生物量