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中华实验外科杂志 2014年第7期31卷 1422-1423页

作者：王军周忠水翟贵亮师大雷王延国马珂山东省滨州市中心医院骨外科 251700

目的观察中胚叶特异性转录子（MEST）在鼠成骨细胞中的表达对细胞迁移及增殖能力的影响。方法取鼠成骨细胞进行培养,利用siRNA干扰片段下调MEST在成骨细胞中的表达,采用Transwell实验检测细胞的迁移能力,细胞计数试剂盒（CCK-8）法及... 详细信息

目的观察中胚叶特异性转录子（MEST）在鼠成骨细胞中的表达对细胞迁移及增殖能力的影响。方法取鼠成骨细胞进行培养,利用siRNA干扰片段下调MEST在成骨细胞中的表达,采用Transwell实验检测细胞的迁移能力,细胞计数试剂盒（CCK-8）法及常用增殖指标细胞核增殖抗原（Ki-67）检测细胞的增殖能力。结果 MEST表达下调后,成骨细胞的迁移数目为（10.0±1.9）个,明显低于空载组[（23.5±2.1）个]及空白对照组[（25.2±1.8）个],差异有统计学意义（P〈0.05）,同时,CCK-8实验表明成骨细胞的增殖能力明显减弱,Ki-67表达明显降低。结论MEST表达对成骨细胞具有促迁移和增殖的作用。

关键词：中胚叶特异性转录子成骨细胞迁移增殖

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硫化氢抑制低剪切应力诱导的内皮间质转化和动脉粥样硬化的机制研究

硫化氢抑制低剪切应力诱导的内皮间质转化和动脉粥样硬化的机制研...

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作者：周坤南华大学

学位级别：硕士

背景:低剪切应力诱导的内皮-间充质转化(Endothelial-mesenchymal transition,End MT)在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用,但其机制仍有待阐明。课题组的前期研究发现HS的外源性供体NaHS显著抑制低剪切应力诱导的ApoE小鼠As斑块形... 详细信息

背景:低剪切应力诱导的内皮-间充质转化(Endothelial-mesenchymal transition,End MT)在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用,但其机制仍有待阐明。课题组的前期研究发现HS的外源性供体NaHS显著抑制低剪切应力诱导的ApoE小鼠As斑块形成以及MEST表达,而且内皮细胞特异性过表达MEST可促进血管内皮细胞发生内皮间质转化进而加剧As病变。对MEST基因结构进行生物信息学分析发现,MEST基因上游存在锌指转录因子NFIL3特异性的识别和结合位点,同时NFIL3的60、175、208位氨基酸为半胱氨酸残基,为HS的潜在巯基化修饰位点。HS能否巯基化修饰这些位点?对这位点的修饰是否影响MEST的表达和End MT以及As发生发展?这些问题值得深入探讨。目的:从HS对NFIL3的巯基化修饰及对MEST表达的调控探索其在低剪切应力诱导的End MT和As中的作用。方法:***小鼠分为对照组和NaHS组,NaHS组小鼠经腹腔注射NaHS(HS外源性供体,剂量为56μmol/kg/d),对照组则经腹腔注射等体积的PBS;两组均进行左颈总动脉局部结扎手术,结扎其颈内动脉、颈外动脉和枕动脉,高脂饮食喂养2周,安乐处死并取其颈动脉,采用H&E和油红O染色检测颈动脉中As病变;免疫荧光检测颈动脉中MEST表达水平;2.高脂饮食喂养的ApoE小鼠分为对照组和内皮细胞特异性敲低MEST组(记为AAV-MEST-RNAi组),喂养16周时安乐处死并取材,采用免疫荧光检测小鼠主动脉MEST的蛋白表达水平;全自动生化分析仪检测小鼠血脂水平;体视显微镜观察、油红O染色检测小鼠主动脉的As斑块;H&E、油红O和Masson染色检测主动脉根部As斑块病理形态;免疫荧光观察主动脉根部斑块区域α-SMA、Vimentin、CD31、VE-Cadherin蛋白表达;***分两种处理形式:剪切应力处理(15dyn/cm(生理层流剪切应力)组和2dyn/cm(低剪切应力组))和低剪切应力+GYY4137(HS供体缓释剂,200mmol/L预处理HUVECs24h)处理(2dyn/cm组和2dyn/cm+GYY4137组),采用Western blotting检测细胞NFIL3、MEST、N-Cadherin、α-SMA、CD31和VE-Cadherin蛋白表达,生物素开关法检测NFIL3的巯基化水平,CHIP-q PCR检测NFIL3与MEST DNA结合水平;***分别转染LV-MEST-RNAi和LV-NFIL3-RNAi后进行低剪切应力处理:分为NC+2dyn/cm组、LV-MEST-RNAi+2dyn/cm组和LV-NFIL3-RNAi+2dyn/cm组,Western blotting检测细胞NFIL3、MEST、v WF、CD31、FAP、Vimentin、α-SMA、N-Cadherin和Tie2蛋白表达;***4137(0、100、200、400mmol/L)预处理HUVECs24h后进行低剪切应力处理,免疫荧光检测NFIL3的核转位情况;6.双荧光素酶报告基因检测NFIL3三个半胱氨酸分别突变为丝氨酸后MEST DNA的启动子活性,以及生物素开关法检测NFIL3突变前后的巯基化水平。结果:1.对照组小鼠的左颈总动脉与右颈总动脉相比,油红O红染的斑块明显增多,MEST表达增多;NaHS组小鼠的左颈总动脉与对照组小鼠的左颈总动脉相比,油红O红染的斑块明显减少,MEST表达减少;2.与Control组相比,AAV-MEST-RNAi组MEST蛋白表达减少了61.42%(P中脂质蓄积减少,主动脉根部As斑块CD31和VE-Cadherin表达增多、Vimentin和α-SMA表达减少;3.与15dyn/cm组相比,2dyn/cm组HUVECs的NFIL3蛋白增加931.31%(P<0.01),添加GYY4137(200μmol/L)预处理后,MEST蛋白下调64.26%(P<0.01),NFIL3蛋白表达水平无明显改变,但其巯基化水平上调99.68%(P<0.01),内皮细胞标志物CD31、VE-Cadherin表达分别增加34%(P<0.01)和102.20%(P<0.05),间充质细胞标志物N-Cadherin和α-SMA表达分别减少76.47%(P<0.001)和48.40%(P<0.001);***-MEST-RNAi成功转染HUVECs,筛选MEST敲低效果最好的一组进行下一步实验;与NC+2dy

关键词：硫化氢 NFIL3 中胚叶特异性转录子低剪切应力内皮间质转化动脉粥样硬化

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H2S抗As的新机制：抑制低剪切应力诱导的血管内皮细胞中MEST表达及其介导的内皮间质转化

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作者：罗雯南华大学

学位级别：硕士

背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)与血管壁的炎症、血管内皮细胞功能以及局部的血流动力学环境紧密相关,其好发于血流缓慢或流动受干扰的部位。低剪切应力诱导的内皮间质转化(Endothelial-to-mesenchymal transition,End MT)在As... 详细信息

背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)与血管壁的炎症、血管内皮细胞功能以及局部的血流动力学环境紧密相关,其好发于血流缓慢或流动受干扰的部位。低剪切应力诱导的内皮间质转化(Endothelial-to-mesenchymal transition,End MT)在As发生发展中发挥重要作用,但其调节机制尚未阐明。综合近期研究发现,中胚叶特异性转录子(Mesoderm-specific transcript,MEST)的表达可被异常剪切应力上调,且MEST可能诱导细胞向间质细胞表型转变。本课题组的前期研究发现MEST在低剪切应力诱导的Apo E小鼠As模型中高表达,但MEST对As病变发生发展的影响尚未见报道。多项研究表明,硫化氢(Hydrogen sulfide,HS)具有血管保护功能,本课题组前期实验中发现HS负性调控低剪切应力诱导的End MT,抑制As病变,且生物信息学预测提示HS有抑制MEST表达的可能性。因此,深入探讨HS对MEST的调控作用及其对End MT的影响可望揭示HS拮抗As的新机制。目的:从对MEST调控角度探讨HS抑制低剪切应力诱导的End MT及对As病变形成的影响与机制。方法:1.使用平行平板流动腔系统予以HUVECs生理层流或低剪切应力处理,采用免疫荧光和Western blotting检测细胞MEST蛋白表达;***予以不同浓度HS缓释剂供体GYY4137预处理后进行低剪切应力处理,Western blotting检测细胞MEST蛋白表达;3.以MEST过表达慢病毒(Lv MEST)和慢病毒空载体(Empty vector,EV)转染HUVECs,采用免疫荧光和Western blotting检测病毒转染效率;***分三组:空载体组、MEST过表达组、MEST过表达+GYY4137(HS缓释剂)组,Western blotting检测细胞CD31、VE-Cadherin、α-SMA、N-Cadherin蛋白表达;5.左颈总动脉局部结扎Apo E小鼠分为两组:对照组和Na HS组,高脂饮食喂养2周后安乐死并取材,采用免疫荧光检测小鼠颈动脉中MEST的蛋白表达;6.高脂饮食Apo E小鼠分为两组:对照组和内皮细胞特异性过表达MEST组,16周时安乐死并取材,采用免疫荧光和Western blotting检测小鼠主动脉中MEST的蛋白表达情况;Western blotting检测小鼠主动脉中间充质细胞标志物N-Cadherin、Vimentin、FAP和a-SMA的表达,以及内皮细胞标志物Tie2、v WF、CD31的表达;免疫荧光和免疫组化观察主动脉根部a-SMA、Vimentin、CD31、Tie2蛋白表达;体视显微镜下观察、油红O染色检测主动脉As斑块面积;HE染色、油红O染色、Masson染色检测主动脉窦As斑块病理形态改变;全自动生化分析仪检测小鼠血脂水平。结果:1.平行平板流动腔实验显示,与生理剪切应力组相比,低剪切应力组HUVECs的MEST蛋白增加123.00%(P中N-Cadherin、Vimentin、FAP和a-SMA蛋白表达分别增加306.10%(P<0.05)、67.01%(P<0.01)、21.12%(P<0.05)和52.42%(P<0.01),Tie2表达减少32.41%(P<0.01),v WF表

关键词：硫化氢中胚叶特异性转录子低剪切应力内皮间质转化动脉粥样硬化

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