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中国林蛙皮肤抗菌肽的分离纯化及生物活性研究

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中国林蛙皮肤抗菌肽的分离纯化及生物活性研究

作者：王雅丽吉林农业大学

学位级别：硕士

抗菌肽(Antimicrobial peptides)也称为肽抗生素,是一类小分子多肽,广泛分布于生物体内。两栖类动物皮肤湿润、裸露,可分泌大量具有抑菌活性的物质,其中以抗菌肽为主。本研究旨在从中国林蛙皮肤分泌的活性物质中提取并进一步分离纯化出... 详细信息

抗菌肽(Antimicrobial peptides)也称为肽抗生素,是一类小分子多肽,广泛分布于生物体内。两栖类动物皮肤湿润、裸露,可分泌大量具有抑菌活性的物质,其中以抗菌肽为主。本研究旨在从中国林蛙皮肤分泌的活性物质中提取并进一步分离纯化出新型的抗菌肽,并对其生物学活性进行研究,为两栖类动物抗菌肽的研究奠定基础。实验蛙间断性电刺激,超纯水收集产生的分泌物,反相高效液相色谱对分泌物分离纯化,将金黄色葡萄球菌(ATCC25923)作为活性试验指示菌进行抑菌效果检测,获得1种抑菌效果较强的抗菌肽,经MALDI-TOF MS质谱鉴定,该抗菌肽纯度达95%以上,序列鉴定表明该抗菌肽的氨基酸序列为FLPFFAACAITKKC(8和14位之间形成二硫键),将其命名为AMP-1。利用多肽固相合成中国林蛙抗菌肽AMP-1、分离纯化,经抑菌活性检测及质谱鉴定,获得目的抗菌肽AMP-1。MIC结果表明:AMP-1对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC25922)有抑制作用,对多重耐药菌株也有一定的抑制效果;溶血试验结果表明:AMP-1最高浓度时溶血率仅为1.108%;抗肿瘤活性试验结果显示:AMP-1对人乳腺癌细胞MCF-7的生长有很强的抑制作用,最高浓度时抑制率可达75.8%,且最低浓度时仍有抑制作用;抗弓形虫活性试验结果显示:AMP-1对弓形虫的抑制作用随浓度的增大而增强,随着时间的延长也会增强。作用72h,50μg/mL的AMP-1对弓形虫的抑制率高达72.5%,而最低浓度时对弓形虫仍具有抑制作用。

关键词：抗菌肽中国林蛙分离纯化抑菌活性

无尾两栖类cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2抗菌肽基因的克隆、结构、表达及进化模式研究

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无尾两栖类cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2抗菌肽基因的克隆...

作者：胡桂林河南师范大学

学位级别：硕士

约3.5亿年前,两栖动物的祖先由水登陆,并逐渐进化出一系列适应陆生生境的改变和特征,因此,两栖动物是脊椎动物进化史上具有特殊和十分重要意义的一个类群,受到进化生物学家和生态学家广泛关注。两栖动物在起源和分化过程中,面临着复杂... 详细信息

约3.5亿年前,两栖动物的祖先由水登陆,并逐渐进化出一系列适应陆生生境的改变和特征,因此,两栖动物是脊椎动物进化史上具有特殊和十分重要意义的一个类群,受到进化生物学家和生态学家广泛关注。两栖动物在起源和分化过程中,面临着复杂多变的生态环境,而两栖类皮肤裸露、缺乏皮肤角质层的保护,因此,免疫适应是两栖动物适应辐射过程中面对环境病原微生物变化首先需要解决的关键问题之一。研究表明两栖动物获得性免疫系统进化尚不完善,先天性免疫系统在其适应复杂多变的栖息地环境过程中发挥着重要作用。作为先天性免疫系统的关键部分,抗菌肽被认为具有广谱抗菌活性,在两栖动物防御外界病原微生物和外界刺激中发挥重要作用。Cathelicidins家族是一类重要的抗菌肽,然而,目前我们对两栖动物cathelicidins抗菌肽家族的组成、结构、进化模式知之甚少。本研究首先以中国林蛙（Rana chensinensis）为研究对象,通过c DNA末端快速扩增技术（RACE）获得了中国林蛙cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2抗菌肽基因的全长c DNA序列,基于序列分析、蛋白质预测及系统发育重建等生物信息学分析揭示了这两个抗菌肽基因所编码的氨基酸组成、结构域、蛋白质理化性质及进化历史。此外,通过实时荧光定量PCR实验及分析揭示了中国林蛙cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2抗菌肽基因的时空表达模式。最后,基于本研究扩增的这两个抗菌肽基因设计了多对引物,进一步通过RACE技术克隆获得了不同生境无尾两栖类代表物种的cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2抗菌肽基因的c DNA序列,利用贝叶斯和最大似然法分别构建了脊椎动物和两栖类cathelicidins系统发育树,并通过PAML软件分析揭示了两栖类cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2的进化模式。结果表明:（1）首次在中国林蛙中克隆获得了cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2基因c DNA全长编码区序列。中国林蛙cathelicidin-AL基因的c DNA序列全长为677bp,CDS长度为561bp,编码186个氨基酸,中国林蛙cathelicidin-RC2基因c DNA序列全长为779bp,CDS共有480bp,编码159个氨基酸。中国林蛙cathelicidin-AL以V132为酶切位点,成熟肽由54个氨基酸组成;cathelicidin-RC2以K123为酶切位点,成熟肽由36个氨基酸组成。其它无尾两栖类cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2的CDS在物种间存在长度差异,cathelicidin-AL的CDS长度范围在543-552bp,cathelicidin-RC2长度范围在468-501bp。无尾两栖类cathelicidin-AL在C80-C92、C103-120形成两个二硫键;cathelicidin-RC2虽然在C75-C86、C97-C108具有4个半胱氨酸,但只形成一个二硫键。（2）组织分布表达显示cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2基因在中国林蛙肺、皮肤、胃、肾、脾脏、脑和肝脏等组织均表达,但在心脏未见表达。cathelicidin-AL在肝脏中表达量最高,其次是脑和脾脏,而cathelicidin-RC2在脑中表达量最高,其次是肝脏和脾脏。cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2基因在肺和皮肤中表达量均不高。（3）脊椎动物系统发育重建表明cathelicidin-AL比cathelicidin-RC2先起源。基于已知的cathelicidin系统发育树结果,我们发现中国林蛙cathelicidin-AL置于系统发育关系的基部,而中国林蛙cathelicidin-RC2与爬行类、鸟类和哺乳类聚为一支。此外,已知两栖类cathelicidins系统发育关系结果表明cathelicidin-RC2和cathelicidin-AL分别聚为一支,支持cathelicidin-AL先分化。（4）无尾两栖类cathelicidin-AL和cathelicidin-RC2选择压力分析表明free ratio model优于one ratio model,显示不同支系受选择压力不同。Branch specific model分析表明cathelicidin-AL在臭蛙属祖先支、武夷湍蛙祖先支、黑斑侧褶蛙祖先支、中华蟾蜍祖先支受到了正选择作用;cathelicidin-RC2在凹耳臭蛙、中国林蛙、黑斑侧褶蛙、树蛙科和叉舌蛙科祖先支中均受到强烈正选择作用。branch site model进一步在凹耳臭蛙支系检测到一个正选择位点（138V）。Cathelicidins基因本身由于末端成熟肽变异程度大,结合c

关键词：中国林蛙无尾两栖类 cathelicidins 抗菌肽进化

Cr、Pb单一及复合暴露对中国林蛙蝌蚪的毒理效应研究

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Cr、Pb单一及复合暴露对中国林蛙蝌蚪的毒理效应研究

作者：杨依婕长安大学

学位级别：硕士

由于工业生产中Cr（VI）和Pb的大量使用,导致水环境中Cr（VI）和Pb浓度持续升高,对水生生物的健康造成潜在威胁。中国林蛙（Rana chensinensis）是我国广布的两栖物种之一,对环境污染物极其敏感,是监测环境污染的良好指示生物。本研究... 详细信息

由于工业生产中Cr（VI）和Pb的大量使用,导致水环境中Cr（VI）和Pb浓度持续升高,对水生生物的健康造成潜在威胁。中国林蛙（Rana chensinensis）是我国广布的两栖物种之一,对环境污染物极其敏感,是监测环境污染的良好指示生物。本研究旨在评估Cr（104μg/L）、Pb（50μg/L）单一及复合暴露对中国林蛙蝌蚪的毒理效应。具体研究内容和结果如下:1.对中国林蛙Gs 26期蝌蚪进行Cr、Pb单一及复合慢性水体暴露,分析了Cr、Pb单一及复合慢性暴露对中国林蛙蝌蚪生长发育、Gs 42和Gs 46期蝌蚪甲状腺组织结构及骨骼骨化的影响。结果表明:暴露18 d时,复合暴露显著抑制蝌蚪的全长、体长和体重;Cr和复合暴露抑制了Gs 42期蝌蚪的全长、体长、体重和后肢长;Cr和复合暴露均导致蝌蚪甲状腺缩小,上皮细胞高度减少。此外,Cr和复合暴露均导致Gs 42和Gs46期蝌蚪骨骼骨化的部分抑制,而Pb暴露可在一定程度上促进骨骼骨化。RT-q PCR分析显示,与对照组相比,Pb处理组中与骨化相关基因FGF13、MMP13、TRβ、SOX9、BMP3的表达水平显著上调。2.分析了Cr、Pb单一及复合暴露对中国林蛙Gs 38期蝌蚪生长、肠道组织结构、消化酶活性和肠道菌群的影响。结果表明:复合暴露导致Gs 38期蝌蚪肠道结构受损明显,细胞边界模糊,细胞核无序排列;复合处理组脂肪酶、淀粉酶及Cr处理组胃蛋白酶活性较对照组相比均有显著改变。此外,与对照组相比,Cr、Pb单一及复合处理组蝌蚪肠道菌群的α多样性（Chao 1指数和Shannon指数）显著增加。β多样性如NMDS分析和样本层级聚类分析均显示各处理组与对照组间差异显著。复合处理组中变形杆菌门（Proteobacteria）和柠檬酸杆菌属的相对丰度,以及Cr处理组中疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）、Akkermansia属和Alpinimonas属的相对丰度较对照组均显著降低,而复合处理组中Anaerotruncus属的相对丰度显著增加。3.基于RNA-seq技术分析了中国林蛙Gs 38期蝌蚪肠道对Cr、Pb单一及复合暴露的响应。采用高通量测序平台对Cr、Pb单一及复合暴露后的中国林蛙Gs 38期蝌蚪肠道转录组进行比较分析。结果表明:各处理组与对照组间的DEGs存在着显著差异,其中,复合处理组与对照组差异最大,有12,421个DEGs（上调DEGs 9978个,下调DEGs 2443个）。此外,选取了6个与脂肪消化吸收相关的基因（CLPS、LIPASE、NPC1L1、PAP、SCARB1、L-FABP）进行比较分析,与对照组相比,各处理组中CLPS基因和LFABP基因表达量下调,而LIPASE基因、NPC1L1基因和PAP基因表达量上调。上述结果显示,环境相关浓度重金属Cr、Pb单一及复合暴露均对中国林蛙蝌蚪产生了一定的影响,但二者的复合影响并非单纯的增强或削弱。本研究为后续进一步作用机制的研究奠定了基础。

关键词：六价铬铅中国林蛙生长发育肠道菌群转录组学

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中国林蛙蝌蚪变态过程中甲状腺的发育

四川动物 2013年第3期32卷 393-397,F0002页

作者：柴丽红王宏元王文科长安大学环境科学与工程学院西安710054 陕西师范大学生命科学学院西安710062

两栖动物幼体变态过程是受甲状腺激素所精密调控的。对中国林蛙Rana chensinensis变态前期、临近变态期、变态高峰期和变态完成期的蝌蚪进行了外部形态指标(全长、体长、尾长和后肢长等)的测定,采用解剖和组织学方法对其甲状腺进行了组... 详细信息

两栖动物幼体变态过程是受甲状腺激素所精密调控的。对中国林蛙Rana chensinensis变态前期、临近变态期、变态高峰期和变态完成期的蝌蚪进行了外部形态指标(全长、体长、尾长和后肢长等)的测定,采用解剖和组织学方法对其甲状腺进行了组织学观察,并对蝌蚪外部形态指标与甲状腺形态机能之间的相关性进行了统计分析。结果显示,中国林蛙蝌蚪甲状腺分泌甲状腺激素机能活性的峰值出现于变态高峰期的前肢伸出期。统计分析表明,蝌蚪外部形态指标全长和后肢长的发育信息也可以反映其甲状腺分泌甲状腺激素的机能活性。

关键词：中国林蛙甲状腺变态幼体

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不同年龄林蛙哈蟆油中营养成分的研究

时珍国医国药 2019年第9期30卷 2259-2262页

作者：宿文杰张玉尧苏航荆礼卢靖张鹤王隶书赵大庆长春中医药大学吉林长春130117 长春中医院大学附属医院吉林长春130021 吉林省中医药科学院吉林长春130012

目的对不同年龄林蛙哈蟆油中营养成分进行检测,分析年龄对哈蟆油品质的影响。方法采集不同质量的林蛙,根据体质量和哈蟆油质量分为8组,分别检测每组哈蟆油中1-甲基海因、总蛋白质、总氨基酸、总多糖和雌二醇的含量。结果2龄及2龄以下的... 详细信息

目的对不同年龄林蛙哈蟆油中营养成分进行检测,分析年龄对哈蟆油品质的影响。方法采集不同质量的林蛙,根据体质量和哈蟆油质量分为8组,分别检测每组哈蟆油中1-甲基海因、总蛋白质、总氨基酸、总多糖和雌二醇的含量。结果2龄及2龄以下的林蛙随蛙重增加,哈蟆油中的1-甲基海因、总蛋白质、总多糖和E2的含量显著增加;性发育成熟之后,3龄林蛙哈蟆油中1-甲基海因、总多糖和E2的含量仍呈现增加趋势,均在蛙重40g组达到最高;4龄以上林蛙,随着蛙重的增加,哈蟆油中各营养成分均降低。结论不同年龄段林蛙哈蟆油中营养价值有一定差异性,从人体营养需求的角度分析,3龄林蛙哈蟆油具有较好的营养价值。

关键词：中国林蛙哈蟆油年龄营养成分

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中国林蛙皮抗菌肽的提取纯化及抑菌活性检测

食品科学 2010年第3期31卷 132-135页

作者：王战勇李宁苏婷婷辽宁石油化工大学环境与生物工程学院辽宁抚顺113001 辽宁石油化工大学化学与材料学院辽宁抚顺113001

采用酸化甲醇法提取中国林蛙皮肤中的抗菌肽,并采用凝胶色谱的方法对提取物进行纯化。结果表明:采用Sephadex G-50和Sephadex G-25串联凝胶层析法获取的F2组分,即纯化后的抗菌肽的抑菌率可达90%以上。抗菌肽对革兰氏阴性菌和阳性菌以及... 详细信息

采用酸化甲醇法提取中国林蛙皮肤中的抗菌肽,并采用凝胶色谱的方法对提取物进行纯化。结果表明:采用Sephadex G-50和Sephadex G-25串联凝胶层析法获取的F2组分,即纯化后的抗菌肽的抑菌率可达90%以上。抗菌肽对革兰氏阴性菌和阳性菌以及真菌均有一定抑制效果。对各受试菌株的最小抑菌浓度(MIC)分别为:金黄色葡萄球菌和链球菌为0.2mg/mL;枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为0.4mg/mL;蜡样芽孢杆菌为0.8mg/mL;白色念珠菌为1.2mg/mL;酿酒酵母和毛霉为1.5mg/mL;根霉为2.0mg/mL。

关键词：中国林蛙抗菌肽纯化抑菌活性

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中国林蛙蝌蚪的口器发育

动物学杂志 2011年第6期46卷 103-110页

作者：史艳飞柴丽红吴民耀王宏元陕西师范大学生命科学学院西安710062 长安大学环境科学与工程学院西安710064

采用扫描电镜和组织学技术观察了中国林蛙(Rana chensinensis)蝌蚪发育过程中口器外部形态结构的变化,以及中国林蛙蝌蚪口器内部结构特征。结果表明,在口器发育的初期,角质颌最先出现,接着出现唇乳突以及唇齿;在变态高峰期(G41～G42),... 详细信息

采用扫描电镜和组织学技术观察了中国林蛙(Rana chensinensis)蝌蚪发育过程中口器外部形态结构的变化,以及中国林蛙蝌蚪口器内部结构特征。结果表明,在口器发育的初期,角质颌最先出现,接着出现唇乳突以及唇齿;在变态高峰期(G41～G42),口器结构如唇齿、角质颌和唇乳突则是按以下顺序消失的,即唇齿最先消失,其次角质颌消失,最后唇乳突消失。通过与其他无尾两栖动物幼体蝌蚪口器的结构比较,表明唇齿行和角质颌形态结构的发育与蝌蚪的觅食行为以及食物类型都是密切相关的。最后探讨了中国林蛙蝌蚪的取食方式和食物转运摄食途径。

关键词：中国林蛙蝌蚪口器显微结构

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中国林蛙多组织转录组差异表达分析

中国林蛙多组织转录组差异表达分析

第八届中国西部动物学学术研讨会

作者：兰月唐瑞祥范振鑫岳碧松濒危动物繁殖与保护四川省重点实验室四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室四川大学生命科学学院

中国林蛙(Rana chensinensis)是一种名贵的中药财,有研究证明"林蛙油"和林蛙皮具有多种营养和药用价值,同时其皮肤也是生产多种抗菌肽的良好资源。林蛙油为雌性林蛙膨大的输卵管,是传统滋补品,林蛙皮可直接入药。为了研究林蛙不同组织... 详细信息

中国林蛙(Rana chensinensis)是一种名贵的中药财,有研究证明"林蛙油"和林蛙皮具有多种营养和药用价值,同时其皮肤也是生产多种抗菌肽的良好资源。林蛙油为雌性林蛙膨大的输卵管,是传统滋补品,林蛙皮可直接入药。为了研究林蛙不同组织的基因表达以及从基因层面探索林蛙各部位的药用价值,本研究分别对林蛙的输卵管、肠、胃等多个组织共45个样品使用RNA-seq进行了转录组测序,使用De Novo的方式完成了中国林蛙转录组的组装,产生了1,085,532条转录本序列,得到一个较为完整的中国林蛙转录组。功能注释在NR,Swiss-Prot,KEGG,COG和GO等5个公共数据库中分别注释到247,668(22.82%),194,620(17.93%),115,785(10.67%),113,311(10.44%)和12,320(17.49%)条转录本,综合多个数据库结果后共计注释了327,867(30.20%)条转录本。基于表达量比较分析鉴定出输卵管组织与其他组织间共计600多个差异表达基因,这些基因显著富集在了多个与免疫反应相关的GO条目。本研究的中国林蛙多组织基因表达数据为今后林蛙药用价值开发提供了基础数据。

关键词：中国林蛙林蛙油多组织转录组差异表达基因

来源： cnki会议评论

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中国林蛙真伪品的PCR鉴别

中国畜牧兽医 2010年第5期37卷 96-98页

作者：郭立宏杜智恒宁方勇白秀娟黑龙江省畜牧研究所齐齐哈尔161005 东北农业大学动物科技学院哈尔滨150030

本研究根据GenBank发表的哺乳类SRY核酸序列和禽类EcoRI家族序列设计1对引物,对中国林蛙真伪品进行了PCR扩增,并对特征条带进行了克隆测序。结果表明,PCR扩增产物有明显的区别,中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙和中华大蟾蜍分别扩增出约100... 详细信息

本研究根据GenBank发表的哺乳类SRY核酸序列和禽类EcoRI家族序列设计1对引物,对中国林蛙真伪品进行了PCR扩增,并对特征条带进行了克隆测序。结果表明,PCR扩增产物有明显的区别,中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙和中华大蟾蜍分别扩增出约1000、250、450、750bp的特征条带,通过对中国林蛙1000bp条带的克隆序列进行BLAST比对分析,找到了一些禽类的WZ染色体上的相关基因片段。

关键词：中国林蛙伪品 PCR鉴别