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4种农药对中华大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪的急性毒性

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安全与环境学报 2016年第6期16卷 377-382页

作者：柴丽红王宏元赵洪峰邓红章长安大学环境科学与工程学院西安710054 长安大学景区地下水文与生态效应教育部重点实验室西安710054 陕西师范大学生命科学学院西安710062

为评价农药对两栖动物的毒性影响,以我国广布物种——中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)和中国林蛙(Rana chensinensis)36期蝌蚪为试验材料,采用静态生物毒性试验方法测定了草甘膦、百草枯、马拉硫磷和溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙... 详细信息

为评价农药对两栖动物的毒性影响,以我国广布物种——中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)和中国林蛙(Rana chensinensis)36期蝌蚪为试验材料,采用静态生物毒性试验方法测定了草甘膦、百草枯、马拉硫磷和溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪的急性毒性效应。结果表明,草甘膦、百草枯、马拉硫磷和溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的96 h-LC_(50)(半致死质量浓度)分别为205.52 mg/L、8.74 mg/L、1.81mg/L和69.14μg/L,对中国林蛙蝌蚪的96 h-LC_(50)分别为184.63 mg/L、6.49 mg/L、1.67 mg/L和65.17μg/L。依据LC_(50),所测试的4种农药对中华大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪的急性毒性大小一致,从大到小均为溴氰菊酯、马拉硫磷、百草枯、草甘膦;但同一种农药对中华大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪的急性毒性大小存在差异,表现为中国林蛙蝌蚪对上述4种农药的敏感性均高于中华大蟾蜍蝌蚪。依据《化学农药环境安全评价试验准则》,对中华大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪而言,草甘膦的急性毒性级别为低毒,百草枯和马拉硫磷的急性毒性级别为中毒,溴氰菊酯的急性毒性级别为剧毒。

关键词：环境科学技术基础学科农药中华大蟾蜍中国林蛙毒性 LC50

Cu^(2+)和Cr^(6+)对中国林蛙蝌蚪的急性毒性

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东北师大学报（自然科学版） 2007年第2期39卷 116-121页

作者：石戈王健鑫武佳王日昕浙江海洋学院海洋科学学院浙江舟山316004

采用中国林蛙(Rana chensinensis)出膜后一周的蝌蚪为实验对象,研究了Cu2+和Cr6+对中国林蛙蝌蚪的急性毒性.实验结果表明,在水温22℃~24℃条件下,Cu2+对中国林蛙蝌蚪24 h,48 h,72 h的半致死浓度(LC50)分别为0.131,0.105,0.038 mg/L;Cu2... 详细信息

采用中国林蛙(Rana chensinensis)出膜后一周的蝌蚪为实验对象,研究了Cu2+和Cr6+对中国林蛙蝌蚪的急性毒性.实验结果表明,在水温22℃~24℃条件下,Cu2+对中国林蛙蝌蚪24 h,48 h,72 h的半致死浓度(LC50)分别为0.131,0.105,0.038 mg/L;Cu2+对蝌蚪的安全浓度为0.02 mg/L.Cr6+对中国林蛙蝌蚪24 h,48 h,72 h的半致死浓度(LC50)分别为4.16,4.48,4.57 mg/L;Cr6+对蝌蚪的安全浓度为1.55 mg/L.同时讨论了中国林蛙与其他两栖类蝌蚪相比对Cu2+和Cr6+耐受性的差异.

关键词：铜离子铬离子中国林蛙蝌蚪急性毒性

DEHP对中国林蛙肝细胞中雌激素受体和卵黄蛋白原合成的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第3期42卷 62-67页

作者：王娟娟李忻怡张育辉陕西师范大学生命科学学院陕西西安710062

【目的】探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对诱导雄性两栖动物肝细胞合成卵黄蛋白原(Vitellogenin,VTG)的影响。【方法】将中国林蛙(Rana chensinensis)雄性成体分别暴露在含10-7,10-6,10-5,10-4 mol/L DEHP的水体中,以自来水为对照,并分别于暴露20,30和40d时取肝脏制作石蜡切片,用免疫组织化学方法检测肝细胞中雌激素受体(Estrogen receptor,ER)和VTG的表达情况。【结果】用不同浓度DEHP处理后,林蛙肝细胞中ER和VTG的相对表达量均显著或极显著高于对照组,且其相对表达量呈现随DEHP浓度的增高而增大的趋势,但二者的相对表达量随暴露时间延长而产生变化的规律性不明显。【结论】ER和VTG表达水平的一致性,揭示DEHP可通过诱导雄性两栖动物肝细胞中ER表达的增高而促使VTG合成。

关键词：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯肝细胞雌激素受体卵黄蛋白原中国林蛙

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中国林蛙蝌蚪期的饲养管理技术

黑龙江畜牧兽医 2010年第5期 145-147页

作者：王春清吉林农业科技学院

中国林蛙皮肤生物活性肽基因的cDNA克隆、序列分析及生物活性的测定

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中国林蛙皮肤生物活性肽基因的cDNA克隆、序列分析及生物活性的测...

作者：虞凤慧辽宁师范大学

学位级别：硕士

两栖类皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质,用来抵御有害环境因子的侵袭,是极具开发潜力的生物资源宝库。中国拥有丰富的两栖类资源,在将近300个亚种中,其中三分之二是特有种,在生物活性物质开发方面具有极大的潜力。但是,由... 详细信息

两栖类皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质,用来抵御有害环境因子的侵袭,是极具开发潜力的生物资源宝库。中国拥有丰富的两栖类资源,在将近300个亚种中,其中三分之二是特有种,在生物活性物质开发方面具有极大的潜力。但是,由于两栖类皮肤生物活性肽在其组织中含量少,分离获得大量的天然产物又很困难,往往不能满足进一步研究的需要。利用分子生物学技术筛选活性肽就成为必然选择,丰富了两栖类活性物质资源库,并为进一步研究活性肽表达及分离纯化奠定基础。本论文以辽宁省抚顺市新宾县地区的中国林蛙作为试验材料,从中国林蛙皮肤中得到一系列活性肽基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法初步分析活性肽基因的序列及结构,进而研究各活性肽的生物活性,为两栖动物活性肽的开发和利用奠定理论基础。首先,根据GenBank中蛙类皮肤生物活性肽信号肽N-端保守序列,设计引物,采用RT-PCR和3′-RACE方法,从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同活性肽前体的cDNA序列,经NCBI数据库中的Blast软件,进行氨基酸序列同源性比较之后,分别命名为:preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。序列分析结果表明,6条编码中国林蛙皮肤生物活性肽前体的cDNA序列全长为289-315bD,编码59-65个氨基酸。其前体由3部分结构域组成:22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体,具有肽链短,C-端酰胺化的特点;preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体,在肽链的C-端含有RANA盒结构,可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键,组成7肽环;preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽,被鉴定为新生物活性肽。人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四种中国林蛙皮肤生物活性肽,抗菌和抗癌活性检测结果表明:它们对金黄葡萄球菌等3种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用,同时抑制乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞生长。其中,temporin-1CEa对金黄葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和乳链球菌抑制作用较强,同时对2种癌细胞有明显的抑制作用,而且溶血作用弱。有望成为新型抗生素和抗肿瘤药物。

关键词：中国林蛙 cDNA克隆序列分析抗菌活性抗癌活性

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中国林蛙生长和繁殖的研究

中国林蛙生长和繁殖的研究

作者：李斌武汉大学

学位级别：硕士

本文对山西霍州和芦芽山地区中国林蛙(Rana chensinensis)的生长、繁殖情况进行了研究。通过骨龄学方法鉴定个体年龄,中国林蛙体长与年龄间显著正相关,体长随着年龄的增加而增长,随着年龄的增加,生长速率减缓。雌雄两性的年龄分布差异... 详细信息

本文对山西霍州和芦芽山地区中国林蛙(Rana chensinensis)的生长、繁殖情况进行了研究。通过骨龄学方法鉴定个体年龄,中国林蛙体长与年龄间显著正相关,体长随着年龄的增加而增长,随着年龄的增加,生长速率减缓。雌雄两性的年龄分布差异显著。在种群内,雌性平均体长显著大于雄性体长,并且平均年龄也呈现这种趋势。这可能是由于雌蛙维持卵巢发育而导致更多的能量向繁殖移动,使雌蛀性成熟延迟,因而体长较大。在种群间,高海拔种群平均体长和年龄明显大于低海拔的种群。种群间,高海拔地区温度相对较低,食物相对缺乏,因此,中国林蛙的活动期相对较短。个成体平均的体长和生理寿命都随着种群活动期的下降而增长。在短动跃期中,个体虽然成长相对较慢,但是性成熟的延迟使个体最终获得较大体长。本文分析了霍州单个种群和芦芽山不同海拔三个种群体长、年龄与窝卵数、卵大小以及窝卵质量间的联系。在同一种群内,体长是影响个体繁殖产量的显著因素,随着体长的增长,窝卵数、卵大小和窝卵质量随之增加。雌体的年龄也是影响个体繁殖产卵的因素。个体年龄虽然与窝卵数和卵大小相关性不显著,但与窝卵质量间呈正相关。在特定的体长范围内,窝卵数与卵大小间存在一种权衡。母体产的窝卵数越多,卵母细胞相对就越小;反之亦然。相对与身体大小的和年龄差异,种群间窝卵数、卵大小和窝卵质量间也有显著差异。种群间,繁殖产量与个体年龄、母体大小相关性不显著,其主要与种群所处的环境条件紧密相关。海拔1900m处,较重的窝卵质量与相对较大的卵相关联;然而在较低海拔地区,较重的窝卵质量与个体窝卵数相联系。

关键词：中国林蛙繁殖产量身体大小年龄生长

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中国林蛙养殖现状及发展对策分析

吉林农业科学 1997年第2期22卷 91-93页

作者：许殿申吉林省农科院长白山所公主岭136100

本文通过对中国林蛙的发展历史、生物学特性、养殖方法及其营养、药用价值的论述，阐明了养殖中国林蛙的重要意义、阻碍林蛙养殖业发展的若干问题以及应采取的相应对策。提出建立林蛙养殖及研究基地、筛选优种林蛙、开展林蛙育种研究、... 详细信息

本文通过对中国林蛙的发展历史、生物学特性、养殖方法及其营养、药用价值的论述，阐明了养殖中国林蛙的重要意义、阻碍林蛙养殖业发展的若干问题以及应采取的相应对策。提出建立林蛙养殖及研究基地、筛选优种林蛙、开展林蛙育种研究、探索集约化人工养殖中国林蛙的途径等是形成研究、生产、加工、销售完整体系的基础和有效措施。

关键词：中国林蛙人工养殖集约化现状对策

中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cDNA克隆及其原核表达载体的构建

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中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cDNA克隆及其原核表达载体的构建

作者：霍芳吉林农业大学

学位级别：硕士

背景与目的：抗菌肽(antibacterial peptides)又叫抗微生物肽(antimicrobial peptides)，肽抗生素(peptide antibiotics)，是由10-50个氨基酸残基组成，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性的小肽，是生物先天免疫系统的重要组成部分。两栖... 详细信息

背景与目的：抗菌肽(antibacterial peptides)又叫抗微生物肽(antimicrobial peptides)，肽抗生素(peptide antibiotics)，是由10-50个氨基酸残基组成，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性的小肽，是生物先天免疫系统的重要组成部分。两栖动物皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境。但在长期的自然选择过程中，它们逐渐形成了防御机制，即由背部及腹部皮肤的分泌抗菌类物质来抵御有害环境因子的侵袭。蛙类皮肤生物活性肽是抗菌肽家族的重要成员，其不但种类繁多，而且数量庞大。通过结构与同源性分析表明这些抗菌肽属于Magainin、Bombinin、Bombinin-like、Brevinin、Esculentin、Ranatuerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin等抗菌肽家族。两栖类抗菌肽具有高效、广谱的抗菌作用，且不易产生耐药性等特点，其这些特性激起了人们极大的兴趣，在耐抗生素病原菌株不断出现的今天，抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物。本研究已成功克隆中国林蛙抗菌肽基因全长cDNA序列，在GenBanK中进行登录(登录号：DQ673105)，并采用生物信息学的方法对核酸序列以及氨基酸序列进行分析，进而对蛋白的结构和功能进行预测、分析，为中国林蛙抗菌肽分子生物学水平研究奠定了基础。同时，将编码成熟抗菌肽基因序列亚克隆至原核表达载体PGEX-3X中，构建重组表达质粒进行IPTG诱导表达。方法：(1)利用反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography RP—HPLC)和质谱(mass spectrometry)检测技术对中国林蛙皮肤分泌物中抗菌肽进行分离纯化和分析，并以革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌(G E.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(G S.aureus)为测试菌株，通过琼脂扩散法对分离出的多肽进行抑菌活性测定。应用Edman降解法对有抑菌活性的多肽物质进行结构鉴定。(2)以N末端氨基酸测序结果(MFTMKKSMLL-)为递交序列，结合NCBI中blastn比对结果设计蛙属抗菌肽简并引物。(3)采用异硫氰酸胍法在无RNase的环境条件下制备中国林蛙皮肤组织总RNA。(4)以提取的中国林蛙皮肤总RNA。为模板，采用3’RACE(Rapid Amplification Of cDNA Ends)技术进行中国林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆，测序分析。同时，运用生物信息学软件对其全长cDNA序列进行阅读框架、同源性比较和相关的生物学功能分析。(5)根据cDNA克隆所获得的中国林蛙抗菌肽基因中编码成熟肽的序列设计合成引物，以全长cDNA序列为模板，通过PCR扩增，获得带有限制性酶切位点的目的片段。(6)采用T／A克隆法将目的序列插入pMD18-T simple克隆载体，测序，正确后将酶切的目的序列亚克隆至经相应限制性内切酶消化处理的原核表达载体pGEX-3X上，构建原核重组表达载体。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，用IPTG进行诱导表达，采用SDS-PAGE电泳进行分析检测。结果：(1)应用RACE技术成功的获得了一条中国林蛙抗菌肽基因的全长cDNA序列。序列全长为297bp，其中包括213bp完整的开放阅读框(open reading frame ORF)，含有84bp的3’非转译区(3’UTR)，推测编码71个氨基酸的多肽，分子量(MW)为7810.9Da，等电点(pI)为5.08。经生物信息学分析表明，中国林蛙CAMPs-3氨基酸序列N末端均含有一个相对保守的由22个氨基酸组成的信号肽(signle peptide)序列，还包含有一个拷贝由个33氨基酸组成的成熟肽(mature peptide)，在信号肽和成熟体之间，是一段富含酸性氨基酸的酸性间隔序列(acidic spacer domain)。经同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性，该序列已被GenBanK收录，登录号为DQ673105。(2)将编码成熟肽的目的序列亚克隆至pMD18-T simple克隆载体中，经测序显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。将酶切后的目的序列插入PGEX-3X原核表达载体中构建重组表达质粒pGEX-chensirin-3，经IPTG诱导后，表达出相对分子质量为30kDa的GST融合蛋白。结论：(1)从中国林蛙皮肤组织中分离出一条新的编码抗菌肽前体CAMPs-3的全长cDNA序列，经NCBI网站中的blastp服务器分析发现与ranatuerin和brevinin家族抗菌肽具有较高的同源性，分别为90％-72％，70％-53％。(2)成功的构建重组融合蛋白表达质粒pGEX-chensirin-3，经诱导，表达出分子量

关键词：中国林蛙抗菌肽 cDNA克隆重组质粒

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中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取纯化及性质研究

中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取纯化及性质研究

作者：郑淼东北林业大学

学位级别：硕士

胶原(Collagen)是由三条肽链组成的螺旋形、纤维状蛋白质,富含于动物的骨、结缔组织和皮肤中,组成胶原分子的肽链被称为胶原蛋白。中国林蛙是重要的特种经济动物,提取林蛙卵油后留下大量的蛙皮废弃物中富含胶原蛋白。研究表明,胶原蛋白... 详细信息

胶原(Collagen)是由三条肽链组成的螺旋形、纤维状蛋白质,富含于动物的骨、结缔组织和皮肤中,组成胶原分子的肽链被称为胶原蛋白。中国林蛙是重要的特种经济动物,提取林蛙卵油后留下大量的蛙皮废弃物中富含胶原蛋白。研究表明,胶原蛋白具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和低抗原性,因此应用领域广泛。主要用于生物医学材料、食品、营养保健品、化妆品等。本文为了充分利用中国林蛙资源,对蛙皮胶原蛋白进行了提取纯化和性质研究。通过测定,得到林蛙皮肤中胶原蛋白含量不少于26%,是一种很好的胶原蛋白提取原料。为提高测定数据的准确性,对消解测定方法进行了修正,建立了适用于中国林蛙皮肤胶原蛋白含量的计算公式,添加了校正因子λ=1.23。并最终得到适合于中国林蛙皮胶原蛋白含量测定的计算公式:M=(C×稀释倍数×总体积/换算系数)×λ。本试验采用酸酶结合提取,破坏一部分肽键,使得胶原变成可以被醋酸溶解的可溶性胶原蛋白,从而达到提取的目的。对酸酶结合提取条件进行了优化,优化后的提取条件为:m(胃蛋白酶):m(原料)=1:50,提取温度37℃,保温时间72h,提取缓冲液50ml 0.5mol/L冰醋酸,提取两次,最终的提取率可达到81.66%,正交试验方差分析表明,酶解温度是影响提取率的重要因素,对结果的影响最为显著。对提取得到的胶原蛋白溶液进行纯化。经过超滤浓缩、盐析沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等纯化步骤后,胶原蛋白溶液浓度达到34.5g/L,纯化倍数为2.326倍,纯度达到96.1%,胶原蛋白总质量1.04g,回收率为39.8%。真空冷冻干燥得到胶原蛋白产品,外观呈松散的絮状,白色略带黄,密度极低,约为0.002g/cm,极易吸水,吸水后有粘滞感,易粘手,聚成片状。经测定中国林蛙皮肤胶原蛋白的含水量为16.44%。等电点为5.8。在273.5nm处有一个较明显的紫外吸收峰。经SDS-PAGE电泳测定,得到两条较明显的条带,分子量分别为107KD和89KD左右,说明本试验得到了胶原分子解链后的两个α组分蛋白。本文首次以中国林蛙皮肤为原料进行胶原蛋白的提纯和性质研究,为深度开发林蛙资源、节约成本做出了有意义的探索。

关键词：中国林蛙胶原蛋白提取纯化