检索结果-南通市图书馆

As-UCH-L5在中国卤虫滞育胚胎重启动中表达模式分析及功能研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

As-UCH-L5在中国卤虫滞育胚胎重启动中表达模式分析及功能研究

作者：王雪辽宁师范大学

学位级别：硕士

中国卤虫(Artemia sinica)是一种具有重要经济和研究价值的小型甲壳动物,恶劣环境条件下会产生滞育卵,滞育卵具有明显抗逆性,当生长环境适宜时滞育胚胎会重新发育。卤虫滞育的发生和重启动机制尚未明确,有待进一步研究。泛素蛋白酶体系... 详细信息

中国卤虫(Artemia sinica)是一种具有重要经济和研究价值的小型甲壳动物,恶劣环境条件下会产生滞育卵,滞育卵具有明显抗逆性,当生长环境适宜时滞育胚胎会重新发育。卤虫滞育的发生和重启动机制尚未明确,有待进一步研究。泛素蛋白酶体系统(UPP/UPS)是真核生物体内保守的蛋白质降解途径,在体内参与细胞的多种生命活动,如细胞周期调控、DNA损伤修复、转录调节等,而泛素蛋白酶体系统主要是依赖泛素化酶和去泛素化酶之间相互作用调控的动态过程。UCH-L5属于去泛素化酶UCHs家族中的一员,具有去泛素化作用,是目前发现的UCHs家族内唯一且与蛋白酶体系统相关的蛋白。因此本研究对UCH-L5在中国卤虫滞育胚胎重启动中发挥的作用及功能进行探究。在本研究中,采用RACE技术对As-uch-l5进行克隆,获得了基因序列长度为1011bp,其中最大开放阅读框为969bp,编码322个氨基酸,预测蛋白质相对分子量约为36k Da,等电点理论值为5.54,生物信息学分析As-UCH-L5是非分泌性的亲水蛋白。通过半定量PCR实验对中国卤虫正常发育7个时期进行m RNA层面的水平分析,结果表明As-uch-l5表达量总体呈逐渐下降趋势;利用Western Blot技术对As-UCH-L5及相关蛋白在中国卤虫正常发育7个时期蛋白层面的水平分析,结果表明As-UCH-L5在0h-10h内表达量先降低,15h开始有所升高,在发育的第3天突增,相关蛋白As-β-catenin和As-c-Myc表达趋势基本都是在0h-10h先下降,15h-20h逐渐上升且达到峰值,40h-3d时又呈现开始逐渐下降的趋势;根据免疫荧光技术对As-UCH-L5进行了亚细胞定位,结果显示As-UCH-L5与细胞核有很大程度的共定位,在中国卤虫全身细胞中几乎均有表达,不具特异性,在发育的第3d时As-UCH-L5在中国卤虫无节幼体的胸部和肠道表达较为突出。为了更加清晰地了解As-UCH-L5在中国卤虫滞育解除胚胎发育重启动中的功能,用As-UCH-L5抑制剂b-AP15处理中国卤虫的滞育胚胎,Western Blot技术分析As-UCH-L5表达模式,经浓度梯度实验确定抑制剂b-AP15浓度为5μM时对As-UCHL5的作用效果最佳,在该浓度下检测了中国卤虫关键发育时期(10h、15h)As-UCHL5和参与信号通路相关蛋白As-β-catenin和As-c-Myc的表达,结果显示这三种蛋白在中国卤虫关键发育时期的表达趋势完全一致,在添加抑制剂实验组蛋白的表达量均明显降低,综上说明在中国卤虫滞育胚胎发育重启动中As-UCH-L5在Wnt-β-catenin信号通路中起调控作用,并且As-UCH-L5对Wnt-β-catenin信号通路呈正向调控作用。为了进一步验证As-UCH-L5在中国卤虫早期胚胎发育过程中的作用,我们检测了添加抑制剂b-AP15作用下中国卤虫关键发育时期的孵化率,结果显示,在加入抑制剂b-AP15之后10h、15h的孵化率与对照组相比都明显降低,由此证明As-UCH-L5在中国卤虫早期胚胎发育过程中起到关键作用。本研究有利于完善卤虫解除滞育以及早期胚胎发育过程中的分子调控机理,为中国卤虫胚胎发育重启动分子机制提供参考。

关键词：中国卤虫去泛素化酶 As-UCH-L5 滞育胚胎重启动细胞周期调控

As-BRE1在中国卤虫滞育胚胎重启动中的表达及功能研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

As-BRE1在中国卤虫滞育胚胎重启动中的表达及功能研究

作者：吴雨菲辽宁师范大学

学位级别：硕士

中国卤虫(Artemia sinica)在面对恶劣的生存条件时有着非常强大的抗逆性,能够通过生产滞育卵来保证种族的延续。当再次碰到良好的生存条件时,接收到外部环境信号的卤虫卵就能结束滞育并重新恢复生长。目前,虽然对卤虫滞育的发生机制已... 详细信息

中国卤虫(Artemia sinica)在面对恶劣的生存条件时有着非常强大的抗逆性,能够通过生产滞育卵来保证种族的延续。当再次碰到良好的生存条件时,接收到外部环境信号的卤虫卵就能结束滞育并重新恢复生长。目前,虽然对卤虫滞育的发生机制已经有了很多研究成果,但对卤虫滞育的解除机制和重启动胚胎早期发育的相关机制还知之甚少,有待于进一步深入研究。在真核生物中,组蛋白H2B的单泛素化(H2Bub1)在染色质生物结构、功能和染色质形成的动力学等方面起着关键作用,而BRE1/RAD6泛素化机制至今仍被认为是H2B单泛素化的唯一驱动者。这种修饰除了对于正确的DNA复制、修复和转录至关重要外,该过程还与多种细胞功能有关,如通过参与稳定染色体凝缩过程,进而参与胚胎发育早期的细胞周期调控等。因此,本研究选择了对BRE1及其在中国卤虫滞育胚胎重启动中的表达及功能展开了一系列实验。本研究采用RACE技术对As-bre1的序列进行克隆,首次获得了完整的As-bre1序列全长共3100bp,转录翻译得到氨基酸921个,所构成的As-BRE1是一种分子质量为107k D、不可溶的亲水性蛋白。通过q RT-PCR和WB实验,对As-bre1和最适条件下、低温胁迫条件下的As-BRE1及其相关蛋白进行了滞育打破后各发育时期表达水平的研究,结果显示:As-bre1与As-BRE1在各个时期的表达水平趋势相同,同时As-BRE1参与介导所得的As-H2BK120ub1表达水平也显示出了相同趋势,都是从滞育打破0h起表达水平开始上升,到15h达到峰值后逐渐下降并保持在一个较低的水平;当外界温度逐渐下降,As-BRE1和As-H2BK120ub1的表达水平也跟着下降。采取免疫荧光技术对As-BRE1和As-H2BK120ub1以及细胞核进行亚细胞定位,结果显示二者所存在的部位高度一致。根据As-BRE1的表达模式及其相关蛋白在打破滞育后各发育时期的表达水平变化以及它们表达部位的结果分析,本研究推测As-BRE1及其相关蛋白不属于抗低温蛋白,而是维持细胞正常生命活动的基础蛋白,并且As-BRE1及其所介导的H2B单泛素化在中国卤虫滞育胚胎重启动后的早期生长发育过程中发挥了重要功能。这项结果有利于推进中国卤虫滞育解除以及重启动胚胎早期生发育相关分子调节机制的研究,同时为BRE1可能通过介导H2B的单泛素化参与多种细胞功能调节的研究提供了有力论据。

关键词：中国卤虫滞育 BRE1 H2B的单泛素化胚胎发育

中国卤虫(Artemia sinica)早期胚胎发育相关基因表达序列标签(ESTs)分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

海洋与湖沼 2008年第2期39卷 139-144页

作者：侯林邹向阳姚锋林盛国徐明玉陈志娟姜丽娟孙文静辽宁师范大学生命科学学院大连116029 大连医科大学基础医学院大连116027

以mRNA差异显示技术分析了中国两性生殖卤虫早期胚胎发育相关基因的表达序列标签(ESTs),共回收了2000条差异条带并进行了克隆、测序,在GenBank/DDBJ/EMBL数据库中用BLASTX和BLASTN软件分别与NCBI上的非冗余核酸序列数据库进行同源性比对... 详细信息

以mRNA差异显示技术分析了中国两性生殖卤虫早期胚胎发育相关基因的表达序列标签(ESTs),共回收了2000条差异条带并进行了克隆、测序,在GenBank/DDBJ/EMBL数据库中用BLASTX和BLASTN软件分别与NCBI上的非冗余核酸序列数据库进行同源性比对,得到分值较高、长度在100bp—2kb以内的ESTs序列133条。所发现的133条ESTs的生物学功能分类为:能量代谢占24%、细胞生长、分裂相关基因占23%、RNA相关占17%、体节形成占12%、蛋白质合成占3%、转录因子占3%、离子转运占5%、细胞信号转导占4%、未知占9%。对所发现的ESTs进行了RT-PCR测定,排除假阳性能够提供足够数量的信息用于获取其全长cDNA,进而获得其全长基因序列以用于功能研究。另外,研究发现了包括小热休克蛋白基因家族、Hox基因家族的abdA和Dfd基因、A-trh基因(排盐器官及盐调节基因)、HIF(缺氧诱导因子)、CK-M2(肌肉型磷酸激酶基因)和GRP基因(富甘氨酸蛋白基因)等20个具有明显功能的相关基因的ESTs和完整基因序列和开放阅读框(ORF)。经初步推断这些ESTs和基因的功能大多为与卤虫发育的生理、生化相关的基因有关。所研究的133条ESTs基本代表了卤虫早期胚胎发育相关功能基因的表达谱。

关键词：中国卤虫早期胚胎发育相关基因表达序列标签

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

海洋湖沼通报 2007年第1期 88-92页

作者：张瑞锋侯林邹向阳赵欣涛王家庆姜丽娟孙文静安家璐曲淑贤辽宁师范大学生命科学学院辽宁大连116029 大连医科大学生物技术系辽宁大连116027 大连医科大学中心实验室辽宁大连116027

中国卤虫(Artemia sinica)是重要的饵料生物,是当前海洋生物学研究的热点生物和重要的生物模型。本文报告了卤虫无节幼体整体荧光原位杂交(WFISH,whole-mount fluorescent in situ hybridization)技术,用于快速对卤虫早期发育相关基因... 详细信息

中国卤虫(Artemia sinica)是重要的饵料生物,是当前海洋生物学研究的热点生物和重要的生物模型。本文报告了卤虫无节幼体整体荧光原位杂交(WFISH,whole-mount fluorescent in situ hybridization)技术,用于快速对卤虫早期发育相关基因的特定时空表达图式进行分析,有助于对卤虫早期发育相关基因功能进行鉴定。人工合成带有FITC标记的卤虫trh基因(trachealess gene)寡核苷酸探针,检测到trh基因在卤虫无节幼体的头部背面盐腺中表达。

关键词：中国卤虫无节幼体整体荧光原位杂交 trh基因

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

辽宁师范大学学报（自然科学版） 2006年第4期29卷 466-469页

作者：侯林姜丽娟孙文静张瑞锋王家庆赵欣涛安家璐辽宁师范大学生命科学学院辽宁大连116029

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ作为染料建立了实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)方法.以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到... 详细信息

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ作为染料建立了实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)方法.以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0.999.溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃.结果表明:本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础.

关键词：中国卤虫 actin基因实时荧光定量PCR

中国卤虫胚胎发育不同时期及不同浓度革兰氏阳性菌刺激下Sp(?)tzle基因的表达

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国卤虫胚胎发育不同时期及不同浓度革兰氏阳性菌刺激下Sp(?)tzl...

作者：于淼辽宁师范大学

学位级别：硕士

卤虫(Artemia)又称盐水丰年虫、丰年虾、卤虾等,在分类学上隶属于节肢动物门(Phylum Arthropoda),甲壳纲(Crustasea),鳃足亚纲(Branchiopoda),无背甲目(Anostacea),卤虫科(Artemidae)中的卤虫属(Artemia)。是一种世界性分布的,广温、耐高盐的小型甲壳动物。Sp(?)tzle基因编码一个神经生长因子样蛋白(NGF-like protein),提示Sp(?)tzle基因与胚胎的生长发育相关,在胚胎背腹轴分化过程中,Easter基因编码的蛋白酶激活Sp(?)tzle使其与卵母细胞腹侧的Toll结合,充分激活腹侧发育途径。此外,Toll途径在无脊椎动物抗真菌及抗革兰氏阳性菌应答诱导抗菌肽表达过程中是必需的,而这一过程中Toll不能直接被外源病原微生物激活,Sp(?)tzle仍作为一个重要的膜外配体存在,当受到感染后肽聚糖识别受体协同作用将信号通过SPE的酶切水解传递到Sp(?)tzle,进而启动Toll途径。本文根据GenBank上A.franciscana基因序列设计引物,以中国卤虫总RNA为模板,经过PCR扩增得到了长297bp的基因片断,用NCBI数据库进行Blastn比对及开放阅读框分析,并用ClustalX 1.83软件对该序列及其假定表达氨基酸序列分别和相近物种的基因序列及氨基酸序列进行比对分析,确认该序列是中国卤虫Sp(?)tzle基因的部分序列,并根据这部分序列设计Real-time PCR引物。本实验用整体免疫组化的方法首次确定了Sp(?)tzle基因在中国卤虫不同发育时期的表达部位。并首次通过RT-PCR技术检测Sp(?)tzle基因在中国卤虫胚胎发育各阶段及在不同浓度革兰氏阳性菌刺激下表达量的变化。实验结果显示Sp(?)tzle基因在卤虫胚胎发育的各个时期持续表达,表达部位主要集中于头、胸、腹部,在发育后期在消化道内壁及鳃叶上也有表达,表达量随着中国卤虫的不断发育呈现一个先降后升的趋势。在受到革兰氏阳性菌刺激后,Sp(?)tzle表达量随着菌浓度的增加也不断增加。推测Sp(?)tzle基因在卤虫胚胎发育的早期与体轴发育背腹轴的形成相关,随着发育的进行及生活环境的变化Sp(?)tzle在卤虫天然免疫应答途径中起重要作用。

关键词：中国卤虫 Toll途径 Sp(a|¨)tzle基因序列分析整体免疫组化 Real-time PCR

中国卤虫甘油激酶基因（As-gk）在胚胎滞育解除过程中的表达模式分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国卤虫甘油激酶基因（As-gk）在胚胎滞育解除过程中的表达模式...

作者：程诚辽宁师范大学

学位级别：硕士

中国卤虫（Artemia sinica）广泛分布于沿海盐池和内陆盐湖中，是一种广温、耐高盐的小型甲壳动物。卤虫具有较强的抗逆能力，在缺氧、高盐、干燥、低温、食物匮乏、日照时间缩短等条件下能产出休眠卵，其胚胎发育被阻滞在原肠胚时期。... 详细信息

中国卤虫（Artemia sinica）广泛分布于沿海盐池和内陆盐湖中，是一种广温、耐高盐的小型甲壳动物。卤虫具有较强的抗逆能力，在缺氧、高盐、干燥、低温、食物匮乏、日照时间缩短等条件下能产出休眠卵，其胚胎发育被阻滞在原肠胚时期。当环境条件适宜时，休眠卵的滞育解除，胚胎发育被重新启动。甘油激酶（glycerol kinase，GK）催化甘油磷酸化反应形成3-磷酸甘油，反应过程中需Mg2+和ATP的参与，是甘油利用过程中的限速酶。3-磷酸甘油是能量代谢及甘油酯的生产过程中一种重要的中间产物。卤虫在滞育过程中积累了大量的甘油作为冷冻保护剂以抵御低温和干旱的伤害，在胚胎发育恢复时，被转化为糖类及其他碳水化合物。因此，甘油激酶在滞育解除过程中发挥重要作用，但其在中国卤虫滞育及滞育解除过程中的作用尚不清楚。本研究采用RACE技术首次得到中国卤虫As-gk的cDNA全长，并对其进行了生物信息学及分子进化方面的分析。As-gk全长2096bp，包含326bp5’和114bp3’非编码区，1656bp的开放阅读框。此基因编码的GK蛋白含有551个氨基酸残基，包含一个典型的glycerol kinase结构域，属于FGGY家族的成员。多序列比对分析表明，GK作为甘油利用与代谢过程中的关键酶，在进化过程中具有结构与功能上的保守性。利用原位杂交技术对As-gk的表达部位进行了分析，As-gk广泛分布于早期发育的胚胎（0-20h）。虫体出现分化后（40h），头胸部、腹部、体表、附肢、消化道和卵巢能检测到阳性信号，与早期哺乳动物和果蝇中对表达部位的研究成果有一定的对应关系。利用原核表达系统在体外诱导表达与纯化出了重组As-GK蛋白。采用荧光实时定量PCR与蛋白免疫印迹技术，对甘油激酶的表达模式进行了研究。结果显示其在卤虫胚胎发育的早期具有较高的表达（10h），表明甘油激酶作为限速酶，在滞育解除后甘油的分解代谢中发挥了重要的作用，伴随滞育期间积累的甘油被逐渐消耗，As-gk转录量下调。As-gk在盐度刺激与温度胁迫下的表达模式分析结果显示，在盐度升高或温度降低时，基因表达显著上调，说明As-gk对温度和盐度的变化有一定的敏感性，在受到低温和高盐的胁迫时表达量升高，起到保护胚胎的作用，证明其是与胁迫相关的蛋白。本研究旨在阐明中国卤虫滞育解除及胚胎发育的早期甘油代谢中GK的作用，对研究卤虫滞育的分子机制具有较为重要的理论意义，对开发利用卤虫资源具有一定的应用价值。

关键词：中国卤虫甘油激酶胚胎发育滞育解除应激

中国卤虫caveolin-1基因的克隆及功能的初步研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国卤虫caveolin-1基因的克隆及功能的初步研究

作者：张巍辽宁师范大学

学位级别：硕士

窖蛋白是细胞膜上特殊内陷结构胞膜窖的标志性蛋白,其主要功能是调节细胞信号转导。窖蛋白-1(Caveolin-1)是构成胞膜窖的主要组成成分。其蛋白质结构中的脚手架区的氨基酸序列高度保守,可以募集内皮细胞生长因子,内皮细胞一氧化氮合酶,G... 详细信息

窖蛋白是细胞膜上特殊内陷结构胞膜窖的标志性蛋白,其主要功能是调节细胞信号转导。窖蛋白-1(Caveolin-1)是构成胞膜窖的主要组成成分。其蛋白质结构中的脚手架区的氨基酸序列高度保守,可以募集内皮细胞生长因子,内皮细胞一氧化氮合酶,G-蛋白,活化的Src家族蛋白激酶和蛋白激酶C等信号分子,并导致下游的信号转导被抑制或者激活。卤虫(Artemia )隶属于节肢动物门,甲壳纲,鳃足亚纲,无甲目,卤虫属,是一种生活在高盐海水或内陆盐湖,适应性极强的小型甲壳动物。卤虫以卵胎生的生殖方式繁殖,但在环境胁迫的极端环境下也通过卵生的方式产生休眠卵或称滞育卵。也正因为如此,休眠胚胎滞育的打破和胚胎发育的过程已成为发育生物的研究热点。本文采用RACE技术扩增了中国卤虫(Artemia sinica)caveolin-1基因的全长序列,并对得到的序列进行了生物信息学分析。用Real-time实时定量PCR定量分析各发育时期和不同环境压力条件下caveolin-1表达量的变化,进而分析卤虫caveolin-1基因的功能。结果如下: (1)通过实验,我们得到长974bp的卤虫caveolin-1基因的全长序列,完整开放阅读框大小为672bp。 (2)经生物信息学分析,ORF区编码了一个含224个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量为25.4KDa,理论等电点为5.48。 (3)卤虫胚胎发育不同时期,不同盐度和菌刺激对卤虫的胁迫实验显示,在0小时,caveolin-1呈高表达;高盐浓度和菌刺激的条件下基因有上调趋势。 (4)推测卤虫caveolin-1可能具有参与先天性免疫并参与胚胎发育和调控细胞周期的功能。

关键词：中国卤虫 caveolin-1基因克隆胚胎发育先天性免疫

中国卤虫胚胎发育过程中V-ATPase基因的表达

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国卤虫胚胎发育过程中V-ATPase基因的表达

作者：孙文静辽宁师范大学

学位级别：硕士

卤虫(Artemia)隶属于甲壳纲(Crustacea)、无甲目(Anostacea)、卤虫属(Artemia)。卤虫广泛分布于内陆盐湖和海岸盐田中,是一个广温广布种。V-ATPase基因广泛存在于原核生物和真核细胞的胞质膜和细胞管泡膜膜系统中, V-ATPase蛋白能够依靠... 详细信息

卤虫(Artemia)隶属于甲壳纲(Crustacea)、无甲目(Anostacea)、卤虫属(Artemia)。卤虫广泛分布于内陆盐湖和海岸盐田中,是一个广温广布种。V-ATPase基因广泛存在于原核生物和真核细胞的胞质膜和细胞管泡膜膜系统中, V-ATPase蛋白能够依靠ATP分解产生的能量作为动力,逆浓度梯度地将H+泵入细胞管泡腔内或泵出细胞外,维持细胞内正常的pH值,保证细胞正常的生理活动,同时也能维持某些细胞器如高尔基体、溶酶体、吞饮小泡和突触小泡内低pH值,这一点对溶酶体的消化功能或受体介导的内吞后受体再循环或高尔基体加工蛋白质等生理活动是必要的.本文根据GenBank上美国卤虫V-ATPase基因的mRNA序列设计引物,以中国卤虫总RNA为模板,经RT-PCR,得到了长1577bp的基因片段,经Blastn比对、ClustalX 1.83软件和MEGA 3.0进行对该序列的假定氨基酸序列和相近蛋白的氨基酸序列进行分子进化分析,确认该序列是中国卤虫V-ATPase基因的序列,与Genebank上Artemia franciscana (AY197611)的相似性97%,根据V-ATPase基因核酸序列,用CLUSTALW (1.82)推断氨基酸序列.V-ATPase基因核酸序列共编码了401个氨基酸序列,与Artemia franciscana的氨基酸序列有98%的相似性.构建的进化树显示它和美国卤虫的V-ATPase亲缘关系最近. Real Time PCR,即实时检测PCR扩增产物并进行解析的方法,至今已经成为基因表达解析的必要手段。本实验应用Real Time PCR技术检测V-ATPase在中国卤虫胚胎发育过程中的表达.在卤虫6个不同胚胎发育时期0h,4h,8h,12h,16h,24h中,V-ATPase的相对表达量是不同的。在卤虫胚胎发育早期12h小时之前,V-ATPase是呈下降趋势,12h过后V-ATPase逐渐上升并在24h小时与16h小时表达量几乎一致。这可能是由于卤虫在胚胎发育12h之前,整体处于一个无氧状态,从而导致V-ATPase相对表达量下降。V-ATPase能够调节H+平衡,将卤虫胚胎细胞内多余的H+排到细胞外,使细胞内呈碱性,阻止细胞凋亡的发生,进而恢复新陈代谢和胚胎发育的过程。这种调节机制对于卤虫适应在无氧条件生存有重要的意义。

关键词：中国卤虫 V-ATPase基因序列分析 Real-time PCR