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柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用

柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用

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作者：尹志超厦门大学

学位级别：硕士

我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病(HFMD)疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除了... 详细信息

我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病(HFMD)疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除了主要病原体肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)外,柯萨奇病毒B组1型(CVB1)也是引起HFMD的重要病原体。研究显示,CVB1感染还可导致无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎等以及与I型糖尿病有关。目前尚无针对CVB1的预防或治疗方法,亟需开展相关防治方法的基础与应用研究。为了进一步建立和完善相关研究技术和方法,本研究基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立了快速高效的CVB1新型中和抗体检测方法(Nt-ELISPOT),为CVB1疫苗和药物研发及血清流行病学研究提供技术支持。本研究以自福建泉州地区分离的CVB1临床分离毒株XM0108株为对象开展相关研究,核酸序列进化分析显示该毒株与我国已报告的CVB1流行毒株高度相近,属于主要流行株。本研究首先对CVB1病毒进行培养与病毒颗粒纯化条件的摸索,建立了较为稳定高效的病毒培养与制备方法,初步建立了病毒原液的浓缩和纯化方法,进一步应用蔗糖密度离心方法获得了具有较高纯度的CVB1病毒颗粒。获得对CVB1病毒具有特异和较好反应性的单克隆抗体是建立基于ELISPOT技术的新型免疫检测方法的重要基础。本研究将经灭活处理后的病毒颗粒以腹腔注射的方式免疫小鼠,利用间接ELISA方法筛选获得了6株抗CVB1的单克隆抗体。通过分析相关单抗对CVB1病毒的结合活性与反应特异性本研究选取具有较好反应性能的2E6单抗作为Nt-ELISPOT检测方法的检测抗体。进一步通过系统摸索Nt-ELISPOT检测方法中酶标检测单抗稀释比例、病毒感染剂量与培养时间,本研究基于ELISPOT技术建立了具有快速和高通量特点的CVB1中和试验方法。与传统的基于细胞病变效应(CPE)的中和试验方法(Nt-CPE),该方法可显著缩短检测时间(从5-7天缩短至1天),并且两种方法的检测结果具有良好的一致性。本研究进一步应用建立的Nt-ELISPOT方法开展了CVB1中和性单克隆抗体的筛选,获得了6株CVB1中和性单克隆抗体。其中5株单克隆抗体亚型为IgG2a,一株为IgG1亚型。中和能力分析显示,其中8A10具有相对更优的中和活性。本研究进一步应用乳鼠感染模型初步评价了8A10与CVB1免疫抗血清的体内抗病毒感染效果。结果显示,8A10与CVB1免疫抗血清通过被动免疫方式可有效保护小鼠免于CVB1的致死性攻击。同时,本研究应用建立新型中和试验方法对厦门地区515份健康人群血清样本进行CVB1中和抗体水平检测。结果显示,上述血清样本的CVB1中和抗体阳性率为27%,其中20-39岁年龄组的血清中和抗体阳性率最高,这提示厦门地区存在CVB1的既往流行感染。综上所述,本研究建立了一种新型的CVB1中和抗体检测方法,可以快速、高效和高通量地应用于CVB1中和抗体的筛选评价以及相关血清流行病学调查,可为CVB1的防治方法研究提供重要支持。

关键词：柯萨奇病毒B组1型中和试验方法酶联免疫斑点检测技术

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