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中华大蟾蜍皮肤Cathelicidin家族新型抗菌肽的鉴定及其抗菌活性

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中国中药杂志 2016年第4期41卷 630-635页

作者：展波高媛媛林维平贾广韬孙同毅李文辉潍坊医学院生物科学与技术学院山东潍坊261053 潍坊医学院临床医学院山东潍坊261053 中国科学院昆明动物研究所云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室云南昆明650223

对中华大蟾蜍皮肤转录组进行了测定,通过对得到转录组数据的组装、注释和序列比对得到1个新型Cathelicidin家族前体c DNA。按照Cathelicidin家族抗菌肽的加工方式,推导出该前体可能编码2个成熟的中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽,命名... 详细信息

对中华大蟾蜍皮肤转录组进行了测定,通过对得到转录组数据的组装、注释和序列比对得到1个新型Cathelicidin家族前体c DNA。按照Cathelicidin家族抗菌肽的加工方式,推导出该前体可能编码2个成熟的中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽,命名为BG-CATH25,BG-CATH29。圆二色散测定了合成BG-CATH25,BG-CATH29的二级结构特征,结果揭示BG-CATH25,BG-CATH29在不同缓冲体系中以无规则卷曲的构象为主。对实验所用4种细菌的抗菌活性研究表明BG-CATH25,BGCATH29对嗜水气单胞菌有较强的抑菌活性,MIC分别为1.25,10 mg·L-1。

关键词：中华大蟾蜍 Cathelicidin 抗菌肽转录组嗜水气单胞菌

基于蟾酥品质评价的我国中华大蟾蜍资源分布特征

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中国中药杂志 2022年第11期47卷 2924-2931页

作者：姜鹏高子阳詹常森上海和黄药业有限公司上海201401 上海市中药固体制剂创新研究中心上海201401

该研究在严格规范蟾酥药材采收条件的前提下,深入研究我国蟾酥药材品质特征和资源分布的关系,为认识我国蟾酥药材地理分布差异及相关特征提供数据支持,为中华大蟾蜍养殖基地的选址和繁育提供重要依据。研究实地采集我国19省42县市105个... 详细信息

该研究在严格规范蟾酥药材采收条件的前提下,深入研究我国蟾酥药材品质特征和资源分布的关系,为认识我国蟾酥药材地理分布差异及相关特征提供数据支持,为中华大蟾蜍养殖基地的选址和繁育提供重要依据。研究实地采集我国19省42县市105个蟾酥药材样品,利用质谱和高效液相色谱,分析物质基础和指标性成分含量,形成我国不同产地蟾酥药材的品质特征数据库。基于蟾酥药材的特征分析,首次发现我国中华大蟾蜍基原蟾酥药材存在以秦岭-淮阳丘陵北缘和黄淮平原连接地带-黄山-天目山为分界线的南、北两大蟾酥药材特征地域(简称“南方”和“北方”蟾酥),鉴定了“南方”和“北方”蟾酥中8个差异显著的物质成分。按《中国药典》2020年版含量测定分析,地理分界线以北的蟾酥样品全部符合含量要求,而分界线以南的蟾酥样品则低于含量要求。中华大蟾蜍所产蟾酥药材品质评价结果表明,我国蟾酥药材品质存在北高南低的情况。研究结果为中华大蟾蜍养殖基地选址和繁殖提供了重要依据。

关键词：中华大蟾蜍蟾酥品质评价分布特征产地

中华大蟾蜍色氨酸羟化酶BbgTPH1基因的克隆、原核表达及功能鉴定

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药学学报 2016年第7期51卷 1158-1164页

作者：刘彦芳陈曦凌鸿刘东春夏明钰王东沈阳药科大学中药学院辽宁沈阳110016 沈阳药科大学中韩分子生药学研究室辽宁沈阳110016 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016

色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase I,TPH1)是催化色氨酸生成5-羟色胺的限速酶,而5-羟色胺不仅是蟾酥的主要活性成分,同时也是中枢神经系统重要的神经递质,具有重要的生理功能。本研究从中华大蟾蜍耳后腺文库中克隆得到中华大蟾蜍色... 详细信息

色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase I,TPH1)是催化色氨酸生成5-羟色胺的限速酶,而5-羟色胺不仅是蟾酥的主要活性成分,同时也是中枢神经系统重要的神经递质,具有重要的生理功能。本研究从中华大蟾蜍耳后腺文库中克隆得到中华大蟾蜍色氨酸羟化酶c DNA。构建原核重组融合表达质粒p MAL-Bbg TPH1,将其导入Escherichia coli TB1中,用IPTG诱导重组菌并优化诱导表达条件。以色氨酸为底物进行体外酶促反应,采用LC-MS法鉴定反应产物。结果显示Bbg TPH1基因c DNA全长为1 984 bp,开放阅读框1 443 bp,编码480个氨基酸,推测蛋白质分子质量为55.2 k Da,理论等电点为5.58,具有芳香族类羟化酶超基因家族的保守结构域和芳香族类羟化酶家族特有的特征信号序列。氨基酸比对分析表明,该基因编码的氨基酸与其他物种TPH1蛋白序列具有较高的同源性。系统进化树显示Bbg TPH1与非洲爪蟾的TPH1亲缘关系最近。Bbg TPH1在E.coli TB1中能够高效表达,其优化表达条件为诱导温度20℃、IPTG浓度0.5 mmol·L-1。酶活检测结果显示,重组Bbg TPH1具有较高催化活性,可将色氨酸转化为5-羟色氨酸。本研究首次获得了蟾蜍属动物色氨酸羟化酶全长c DNA序列,并验证了其催化功能,为进一步研究蟾蜍中蟾毒色胺类化合物的生物合成分子机制以及次生代谢调控等提供了科学依据。

关键词：中华大蟾蜍色氨酸羟化酶 c DNA 原核表达

中华大蟾蜍EDF-1重组蛋白的原核表达、纯化及抗血清的制备

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生物技术通报 2018年第10期34卷 129-134页

作者：刘怡君贾宇坤王玲芳刘虹杏杨仙玉浙江农林大学动物科技学院临安311300

通过实验获得中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)内皮分化相关因子-1(Endothelial differentiation related factor-1,EDF-1)重组蛋白及高效价抗血清。在前期研究工作中已克隆中华大蟾蜍EDF-1的开放阅读框(Open reading frame,ORF)(GenBank登录号K F769459),但因密码子的偏好性使中华大蟾蜍原有密码子在原核细胞中发生识别困难,重组蛋白原核表达未能成功。本文对中华大蟾蜍的EDF-1的ORF进行密码子优化,委托公司合成并插入原核表达载体,构建重组质粒pET-28b-EDF-1-Bufo。将重组质粒转入大肠杆菌(E. coli)感受态细胞BL21(DE3),使用IPTG诱导重组蛋白表达,钴胶纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白免疫小鼠制备鼠抗重组中华大蟾蜍EDF-1的抗血清,然后通过Western-blot和ELISA检测抗血清的特异性及其效价。重组中华大蟾蜍EDF-1得到良好表达,抗血清特异性良好,效价为1∶8 000。为进一步研究EDF-1的生物学功能奠定基础,同时为研发抑制内皮细胞分化相关的抗肿瘤药物提供重要参考。

关键词：中华大蟾蜍内皮分化相关因子-1 重组蛋白表达密码子优化

中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶基因的克隆、表达与生物信息学分析

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中国当代医药 2023年第33期30卷 21-26页

作者：陈曦武梦云王东中国航空工业集团公司洛阳电光设备研究所综合门诊部河南洛阳471000 沈阳药科大学中药学院辽宁本溪117004

目的为获得中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶(NSDHL)以便于研究其功能,本文建立了该重组蛋白原核表达方法。方法以中华大蟾蜍耳后腺总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆中华大蟾蜍NSDHL基因(Bbg-NSDHL),对Bbg-NSDHL基因进行生物信息学分... 详细信息

目的为获得中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶(NSDHL)以便于研究其功能,本文建立了该重组蛋白原核表达方法。方法以中华大蟾蜍耳后腺总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆中华大蟾蜍NSDHL基因(Bbg-NSDHL),对Bbg-NSDHL基因进行生物信息学分析,并以大肠埃希菌为宿主菌,采用pCOLD-TF表达载体,构建Bbg-NSDHL原核表达系统,优化诱导表达条件。结果Bbg-NSDHL cDNA全长1521 bp,开放阅读框长1038 bp,编码345个氨基酸,所表达蛋白分子量为38.6 kD,理论等电点为8.70,分子式为C_(1756)H_(2729)N_(455)O_(495)S_(14)。Bbg-NSDHL具有核苷二磷酸糖差向异构酶结构域和短链脱氢酶/还原酶超家族结构域,在270-292处存在1个明显的跨膜区。Bbg-NSDHL单体由5个α-螺旋和9个β-折叠组成。系统进化分析表明,Bbg-NSDHL与两栖动物的NSDHL聚为一类,与哺乳动物遗传距离较远。Rosetta菌株为Bbg-NSDHL重组蛋白表达适合宿主,最佳诱导条件为15℃条件下,细菌生长至OD_(600)值为1.0时,加入0.1 mmol/L的IPTG诱导24 h。去除Bbg-NSDHL跨膜区截短表达可显著提升Bbg-NSDHL重组蛋白表达量。结论本研究首次获得了中华大蟾蜍NSDHL cDNA全长序列,并建立了Bbg-NSDHL原核表达系统,为进一步研究该基因在中华大蟾蜍蟾毒配基类成分生物合成中的作用奠定了基础。

关键词：中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶生物信息学分析原核表达

中华大蟾蜍细胞色素P450还原酶基因克隆、表达与功能鉴定

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上海中医药大学学报 2024年第1期38卷 27-33页

作者：肖传光胡耀廷杨莉赵淑娟王峥涛上海中医药大学中药研究所中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室中药标准化教育部重点实验室上海市复方中药重点实验室上海201203

目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证。方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCP... 详细信息

目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证。方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCPR基因两端特异性引物,以蟾蜍肝脏组织总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增。利用生物信息学分析BgCPR蛋白理化性质、空间结构并构建系统进化树;基于CRISPR/Cas9基因编辑系统将蟾蜍BgCPR基因表达框经同源重组整合进入酿酒酵母基因组,利用聚乙二醇法制备转化子微粒体,验证其对细胞色素C的还原功能。结果:克隆得到全长2043 bp的BgCPR基因cDNA,编码680个氨基酸,相对分子质量77852 Da。结构预测显示,BgCPR蛋白为非分泌蛋白;有一段跨膜螺旋区,位于蛋白的第24~46位氨基酸之间;亚细胞定位预测显示该蛋白定位于内质网上。采用体外酶活实验证明其具有传递电子功能。结论:本研究克隆得到中华大蟾蜍BgCPR基因,并构建了表达具有生物活性的BgCPR的酿酒酵母工程细胞,为进一步研究蟾蜍CYP450基因功能乃至解析蟾蜍二烯内酯类化合物的生物合成途径奠定了基础。

关键词：中华大蟾蜍细胞色素P450还原酶细胞色素P450 蟾蜍二烯内酯

中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）和中国林蛙（Rana chensinensis）尾吸收分子机制探究

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中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）和中国林蛙（Rana chensinensis...

作者：梁智佳陕西师范大学

学位级别：硕士

两栖动物变态过程是由甲状腺激素精确调控的一个胚后发育过程。在这个胚后发育过程中,蝌蚪将会发生众多的生理生化过程,引起蝌蚪体内组织和器官的变化,如尾部吸收过程。在蝌蚪的尾部吸收过程中,蝌蚪尾部逐步吸收,蝌蚪的运动方式将会从... 详细信息

两栖动物变态过程是由甲状腺激素精确调控的一个胚后发育过程。在这个胚后发育过程中,蝌蚪将会发生众多的生理生化过程,引起蝌蚪体内组织和器官的变化,如尾部吸收过程。在蝌蚪的尾部吸收过程中,蝌蚪尾部逐步吸收,蝌蚪的运动方式将会从尾部泳动转变为四肢肢体运动。两栖动物蝌蚪的尾部吸收过程是两栖动物变态过程中的一个重要事件,从进化角度上看,这对于两栖动物适应从水生生活过渡到陆生生活具有重要的意义。在蝌蚪尾部吸收过程中,蝌蚪尾部不仅进行形态学改变,它还伴随着复杂的生理生化过程以及多个细胞过程。在这些过程中,细胞凋亡和自噬过程已经被证明在多种两栖动物的尾部吸收过程中发挥着重要的作用,是两栖动物尾部吸收的分子机制之一。但是,在中华大蟾蜍和中国林蛙的尾部吸收过程中,细胞凋亡和自噬过程是否参与其尾部吸收,或者在尾部吸收过程中是否还有其他的细胞过程参与还尚未可知。因此,我们对中华大蟾蜍和中国林蛙的尾部吸收过程进行研究,旨在探究中华大蟾蜍和中国林蛙的尾部吸收的分子机制。本研究以中华大蟾蜍和中国林蛙为研究对象,采用形态学,组织学,实时定量PCR技术（RT-qPCR）以及转录组测序等方法,对中华大蟾蜍和中国林蛙尾部吸收过程的分子机制进行探究。本研究分为两大部分。第一部分,我们对中华大蟾蜍尾部吸收过程及其分子机制进行探究:我们首先对Gs38-46期的中华大蟾蜍蝌蚪尾部的形态学变化进行观察拍照,测量并记录Gs38-46期的蝌蚪尾部长度,随后通过HE和Masson染色,对Gs38,42,44期蝌蚪尾部进行组织学染色,观察蝌蚪尾部吸收过程中的不同组织的组织学变化。此外,我们还通过转录组测序以及RT-qPCR技术,对林蛙尾部和后肢的差异表达基因进行筛选分析,得到尾部吸收过程相关的候选基因,并通过RT-qPCR对Gs38,42,44期的中华大蟾蜍蝌蚪尾部吸收过程相关的候选基因的表达量进行测定。第二部分,我们探究了林蛙的尾部吸收过程及其分子机制:通过对林蛙尾部进行观察拍照,我们对林蛙尾部吸收过程的形态学变化进行记录,并且测量记录Gs38-46期的蝌蚪尾部长度。随后,通过HE和Masson组织学染色观察Gs38,42,44期的林蛙蝌蚪尾部的组织学变化。最后,运用转录组测序技术,我们对林蛙尾部和后肢的差异表达基因进行筛选与分析,得出尾部吸收过程的候选基因,并对其进行验证。结论如下:1.我们的形态学测量结果显示,中华大蟾蜍和中国林蛙蝌蚪在变态高峰期之前,尾部吸收速度较慢,达到变态高峰期Gs42期后,尾部吸收速度突然加快,直至Gs46期蝌蚪尾部完全吸收。2.HE和Masson染色的组织学结果显示,中华大蟾蜍尾部吸收过程中,尾部的快肌和慢肌通过凋亡进行吸收,快肌在Gs40期开始凋亡消失,而慢肌在Gs40期之后才开始凋亡,并且在肌肉凋亡的过程中,黑色素巨噬细胞可能发挥了重要作用。此外,脊索的组织学切片染色结果显示,成纤维细胞可能先侵入脊索,造成脊索皱缩,然后再进入脊索鞘,使之降解。3.转录组测序结果表明,中华大蟾蜍和中国林蛙蝌蚪尾部和后肢之间存在众多差异表达基因。我们对差异表达基因进行分析和筛选。我们发现凋亡相关基因CASP6和APAF1,自噬相关基因ATG5和ATG7显著上调。结果表明,凋亡和自噬可能参与尾部吸收过程。4.我们采用组织学方法对Gs38,42和44期蝌蚪甲状腺的切片显示,Gs42期时滤泡上皮细胞高度最大,甲状腺活性最高,提示甲状腺分泌甲状腺激素水平达到峰值。Gs38和Gs44期甲状腺分泌水平较低。5.实时定量PCR（RT-qPCR）结果显示,在中华大蟾蜍蝌蚪变态过程中,相比于Gs38期,Gs42期的凋亡相关基因CASP6和APAF1,自噬相关基因ATG5和ATG7,细胞组分降解相关基因MMP9以及脱碘酶D2和TH受体的TRβ均显著上调,而氧化应激相关基因GPX,SOD，HSP90,脱碘酶D3和TH受体TRα显著下调。结果表明,凋亡,自噬和细胞组分降解细胞过程可能参与尾部吸收。然而,蝌蚪尾部氧化应激相关基因GPX,SOD,HSP90显著下调,抗氧化能力下降,导致活性氧积累,引起细胞死亡。因此,我们认为氧化应激也可能参与蝌蚪的尾部吸收过程。综上所述,中华大蟾蜍和中国林蛙的尾部吸收过程是一个复杂的过程,该过程由凋亡,自噬,细胞组分降解和氧化应激等细胞过程共同调控,并且TH受体和脱碘酶也能够影响蝌蚪尾部吸收过程。本研究为中华大蟾蜍和中国林蛙蝌蚪尾部吸收过程的进一步研究提供实验和理论依据。

关键词：中华大蟾蜍中国林蛙尾部吸收凋亡自噬

同方学位论文库评论

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中华大蟾蜍蟾酥中蟾毒内酯类化学成分研究

中国中药杂志 2014年第5期39卷 841-845页

作者：张鹏伟江仁望叶文才田海妍暨南大学药学院中药及天然药物研究所广东广州510632

采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、凝胶柱色谱、制备型高效液相等方法从蟾酥的二氯甲烷萃取部位中分离得到12个蟾毒内酯类化合物,根据化合物的理化性质和波谱数据分别鉴定为脂蟾毒配基(1)、蟾蜍它灵(2)、去乙酰华蟾蜍精(3)、19-氧去乙酰华蟾... 详细信息

采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、凝胶柱色谱、制备型高效液相等方法从蟾酥的二氯甲烷萃取部位中分离得到12个蟾毒内酯类化合物,根据化合物的理化性质和波谱数据分别鉴定为脂蟾毒配基(1)、蟾蜍它灵(2)、去乙酰华蟾蜍精(3)、19-氧去乙酰华蟾蜍它灵(4)、华蟾蜍它灵(5)、1β-羟基蟾蜍灵(6)、12α-羟基蟾蜍灵(7)、蟾蜍它里灵(8)、嚏根草配基(9)、远华蟾蜍精(10)、嚏根草醇(11)及华蟾蜍精-3-辛二酰甲酯(12)。化合物7和12为首次从蟾酥中分离得到,且为新天然产物。

关键词：中华大蟾蜍蟾酥蟾毒内酯化学成分

基于RNA-seq技术的不同发育期中华大蟾蜍耳后腺和腹皮转录组比较分析

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基因组学与应用生物学 2024年

作者：陈文潇陈晶郭媛媛洪永健胡晶红张金山东省质量控制与中药全产业链建设协同创新中心山东中医药大学药学院

通过对中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)5个不同发育时期的耳后腺和腹皮进行转录组测序分析，挖掘参与毒素合成的关键因子，为深入研究毒素合成调控机理提供理论依据。分别取3月龄、6月龄、12月龄、24月龄、36月龄等5个发育时期的中... 详细信息

通过对中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)5个不同发育时期的耳后腺和腹皮进行转录组测序分析，挖掘参与毒素合成的关键因子，为深入研究毒素合成调控机理提供理论依据。分别取3月龄、6月龄、12月龄、24月龄、36月龄等5个发育时期的中华大蟾蜍耳后腺和腹部皮肤进行转录组测序，利用GO和KEGG对差异表达基因功能进行分析，利用加权共表达网络分析筛选关键基因。将处于相同发育时期腹皮与耳后腺的转录组数据进行比较，分别筛选出3 053、3 026、1 516、1 028和2 061个差异表达基因。由GO分类统计结果可知，差异表达基因在生物过程类别主要集中于细胞过程、单一生物体过程、代谢过程和生物调节；在细胞组分类别主要聚集于细胞组分和细胞器；在分子功能类别主要富集于结合蛋白、催化活性等方面。对差异表达基因进行KEGG通路分析表明，在蟾蜍发育过程中参与多条通路，如酪氨酸代谢、过氧化物酶体和初级胆汁酸代谢等。将5个发育时期的共同差异表达基因比较，筛选出与类固醇代谢、初级胆汁酸代谢和过氧化物酶体相关的21个基因，利用加权共表达网络分析筛选出4个模块的6个关键基因。在不同发育时期中华大蟾蜍的皮肤与耳后腺差异表达基因中，大量代谢途径基因发生了富集，这些基因可能在调控耳后腺毒素合成中具有重要作用，为解析蟾蜍产毒分子机制奠定了基础。

关键词：中华大蟾蜍产毒基因转录组分析差异表达基因