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两歧双歧杆菌B11调控肠道屏障的体外研究

中国乳品工业 2024年第5期52卷 11-15页

作者：贾晓蒙路江浩李思童李旭阳贾洪利梁丛丛霍文敏郭润晴杨玲河北一然生物科技股份有限公司研发中心石家庄050000

文章以肠道菌群体外批量发酵系统与HT-29细胞相结合,分析了两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)B11对肠道机械屏障的调控及对产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic ***,ETEC)的拮抗作用,通过对巨噬细胞RAW264.7影响,探讨B11对免疫屏... 详细信息

文章以肠道菌群体外批量发酵系统与HT-29细胞相结合,分析了两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)B11对肠道机械屏障的调控及对产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic ***,ETEC)的拮抗作用,通过对巨噬细胞RAW264.7影响,探讨B11对免疫屏障的调控。结果表明,两歧双歧杆菌B11可在体外发酵条件下拮抗ETEC对HT-29的损伤,提高HT-29黏蛋白MUC2和MUC5AC、紧密连接蛋白ZO-2、Claudin-1和Occudin的mRNA相对表达率至3.78、1.75、4.86、4.06和3.29。经过B11菌悬液处理RAW264.7细胞的相对增殖率提升(17.48±2.49)%,吞噬率提升(21.63±9.85)%,促进了细胞因子IL-12和TNF-α的分泌(P两歧双歧杆菌B11能够增强肠道机械屏障和免疫屏障。

关键词：两歧双歧杆菌肠道屏障产肠毒素性大肠杆菌免疫益生菌

利用2'-岩藻糖基乳糖生长的两歧双歧杆菌BD-1免疫调节功能评价

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中国微生态学杂志 2024年第7期 745-752+760页

作者：许晓林王斯栌陈菲逯畅李倪亚程如越何方沈曦四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院

目的探究两歧双歧杆菌BD-1(Bifidobacterium bifidum BD-1, BD-1)以2-岩藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose,2'-FL）作为唯一碳源时，与葡萄糖相比，其菌体和代谢产物诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌细胞因子的效应，以探索BD-1菌利用... 详细信息

目的探究两歧双歧杆菌BD-1(Bifidobacterium bifidum BD-1, BD-1)以2-岩藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose,2'-FL）作为唯一碳源时，与葡萄糖相比，其菌体和代谢产物诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌细胞因子的效应，以探索BD-1菌利用母乳低聚糖后免疫调节的菌株特性。方法（1）菌体部分干预实验：将BD-1活菌接种于不同碳源的改良MRS肉汤培养基中，改良过的MRS肉汤培养基包括以2%2'-FL作为唯一碳源（2'-FL组）和以2%葡萄糖作为唯一碳源（Glu组）的培养基。将接种后的BD-1活菌在厌氧条件下培养24 h后，分离各组菌体和培养基上清液。将菌体部分与RAW264.7细胞共同培养，并以肽聚糖（peptidoglycan,PGN）为菌体成分对照，同时设置不添加干预物的阴性对照（Ctrl组）。（2）菌体代谢产物部分干预实验：将培养基上清液与RAW264.7细胞共同培养，以含有2%2'-FL或葡萄糖但未进行BD-1菌发酵处理的培养基作为实验对照，并设置不添加干预物的培养基与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阴性对照（Ctrl组），以PGN与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阳性对照（PGN组）。培养24h后，提取RAW264.7细胞总RNA，逆转录后采用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-10、IL-12、IL-1β的基因表达量；收集各组受试物与RAW264.7细胞的共培养上清液，采用酶联免疫吸附试验检测共培养上清液中上述细胞因子的分泌量。结果（1）菌体部分干预：与PGN组相比，菌体部分2'-FL组和Glu组的TNF-α、IL-6、IL-10分泌量及基因表达量显著上升（均P<0.05）。与Glu组相比，2'-FL组的IL-6、IL-10分泌量显著下降（均P<0.05）,IL-6、IL-10的基因表达具有下降趋势。（2）菌体代谢产物部分干预：BD-1-2'-FL上清组和BD-1-Glu上清组的TNF-α、IL-6及IL-10分泌水平以及基因表达水平较2'-FL组和Glu组（未进行BD-1菌发酵处理的组别）有显著提高（均P<0.05），而且2'-FL组中IL-6、IL-10的分泌量较Glu组显著增加（均P<0.05）,IL-6表达水平显著升高（均P<0.05）,IL-10表达水平有升高的趋势。2'-FL组相较于Glu组能产生更多的有机酸和种类更为丰富的糖类物质。结论利用母乳低聚糖或葡萄糖作为唯一碳源培养BD-1菌体和诱导巨噬细胞分泌细胞因子的特征存在差异。当BD-1以母乳低聚糖为唯一碳源时，与葡萄糖相比，菌体成分呈现出抗炎倾向，在巨噬细胞中表现为IL-6的分泌和基因表达能力下降；而其代谢产物则具有刺激免疫激活的趋势，在巨噬细胞中导致IL-6和IL-10的分泌及基因表达能力上升。

关键词：两歧双歧杆菌母乳低聚糖 RAW264.7细胞肿瘤坏死因子-α 白细胞介素

基于比较基因组学解析两歧双歧杆菌B1628遗传背景及潜在益生基

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食品与发酵工业 2024年

作者：田桂铭周润芝吴琼赵飞燕李伟程于洁内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

该研究团队前期从健康婴儿粪便分离得到有较好耐酸耐胆盐能力的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B1628，其灭活菌体可以缓解炎症性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)小鼠结肠炎症性水肿，具有潜在应用价值。该研究基于生... 详细信息

该研究团队前期从健康婴儿粪便分离得到有较好耐酸耐胆盐能力的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）B1628，其灭活菌体可以缓解炎症性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)小鼠结肠炎症性水肿，具有潜在应用价值。该研究基于生物信息学分析探究B. bifidum B1628的遗传背景和潜在益生基因，为其开发应用提供理论指导。对B. bifidum B1628进行Illumina与Oxford Nanopore结合的全基因组测序，结合NCBI Refseq数据库中119株B. bifidum基因组进行比较基因组学分析。B. bifidum B1628基因组仅有1条2 234 414 bp的环状染色体且不含质粒，GC含量为62.4%，包含1 769个蛋白质编码区。120株B. bifidum共包含6 554个泛基因，呈开放型。基于987个核心基因构建系统发育树，120株B. bifidum聚为8个不同的分支，呈地区聚集性，B. bifidum B1628属于分支1，该分支菌株均分离自中国。功能分析发现B. bifidum B1628包含叶酸、色氨酸、乳酸合成基因，耐酸、耐胆盐、氧化应激等与环境压力相关基因以及CRISPR-Cas适应性免疫系统。该研究揭示了B. bifidum B1628全基因组特征，发现多个潜在益生基因，为该菌株开发利用及产业化提供数据参考。

关键词：两歧双歧杆菌比较基因组学遗传背景潜在益生基因

两歧双歧杆菌FL-228.1增强小鼠先天免疫功能研究

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食品工业科技 2023年第22期44卷 335-341页

作者：周瑜田晓英崔庆宇张喆公丕民林凯易华西刘同杰张兰威中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266000

本文以8株潜在功能菌株为研究对象,将其分别干预RAW264.7鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞(PBMCs),并检测RAW264.7细胞吞噬活性和自然杀伤(NK)细胞活性变化,将筛选出的潜在益生菌进一步干预BALB/c小鼠,探究其在体内的免疫调节功效。结果表... 详细信息

本文以8株潜在功能菌株为研究对象,将其分别干预RAW264.7鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞(PBMCs),并检测RAW264.7细胞吞噬活性和自然杀伤(NK)细胞活性变化,将筛选出的潜在益生菌进一步干预BALB/c小鼠,探究其在体内的免疫调节功效。结果表明,在细胞实验中,不同菌株干预均能显著提高RAW264.7细胞吞噬活性(P两歧双歧杆菌FL-228.1和鼠李糖乳酪杆菌FN518能显著提高NK细胞活性(P两歧双歧杆菌FL-228.1在体外表现效果最优,进一步开展体内研究。摄入两歧双歧杆菌FL-228.1能促进小鼠胸腺发育并显著提高腹腔巨噬细胞吞噬活性,脾脏中NK细胞活性,血清IgG含量,脾淋巴细胞转化和抗菌肽相关基因Cryptdin-4和CRAMP的表达(P0.05)。综上,两歧双歧杆菌FL-228.1可以通过调节免疫细胞活性、细胞因子表达以及免疫分子抗菌肽相关mRNA水平来提高先天免疫功能并对免疫系统具有较全面的改善作用。

关键词：两歧双歧杆菌先天免疫巨噬细胞自然杀伤细胞抗菌肽

两歧双歧杆菌调控肠道生物屏障改善抗生素引起的肠动力及结构损伤

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食品与发酵工业 2023年第24期49卷 21-28页

作者：余强庆唐楠王嘉良梅春霞王琳琳王刚张灏赵建新江南大学食品学院江苏无锡214122

口服抗生素会改变肠道微生物区系的组成。该研究检测了不同抗菌谱抗生素对小鼠肠动力、肠道结构以及肠神经的影响,然后评估了不同来源两歧双歧杆菌对广谱抗生素造成的小鼠肠道结构、功能及肠神经损伤的修复潜力。在第一项研究中,应用抑... 详细信息

口服抗生素会改变肠道微生物区系的组成。该研究检测了不同抗菌谱抗生素对小鼠肠动力、肠道结构以及肠神经的影响,然后评估了不同来源两歧双歧杆菌对广谱抗生素造成的小鼠肠道结构、功能及肠神经损伤的修复潜力。在第一项研究中,应用抑制G+细菌的抗生素(氨苄青霉素),抑制G-细菌的抗生素(庆大霉素)以及广谱抗生素处理小鼠21 d,对小鼠小肠长度、结肠长度、盲肠重量、小肠推进率、整个肠道转运时间以及结肠肠神经指标进行了检测,结果发现抑制G-细菌的抗生素对肠道结构,功能和肠神经系统的影响显著大于其余2组。在第二项研究中,针对广谱抗生素处理组,应用3株两歧双歧杆菌对其干预7 d,检测两歧双歧杆菌对小鼠肠动力、肠道结构和神经系统的影响情况,结果表明两歧双歧杆菌45M3可通过调节肠道生物屏障修复由广谱抗生素所引起的肠道结构和功能的损伤。综上所述,不同抗菌谱抗生素对小鼠肠道结构、肠动力及肠神经具有不同的影响,其中抑制G-细菌的抗生素影响最大,而两歧双歧杆菌45M3具有修复广谱抗生素所引起的肠道结构和功能损伤的潜力。该研究为服用抗生素后补充益生菌提供了理论依据,也为开发提升国民健康的新型功能食品提供新的思路。

关键词：两歧双歧杆菌抗生素肠道结构生物屏障

两歧双歧杆菌CCFM1167通过提升肠道中乙酸水平以抑制炎症从而缓解便秘

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食品与发酵工业 2023年第6期49卷 35-41页

作者：李亦汉王琳琳赵建新张灏王刚陈卫江南大学食品学院江苏无锡214122

便秘(constipation)是一种临床常见疾病,发病率逐年上升。大量研究证明补充特定益生菌可以缓解便秘。因此该研究选取3株不同来源的双歧杆菌,研究其对便秘的缓解作用并进一步探究其可能的缓解途径。使用双歧杆菌干预小鼠4周,期间用盐酸... 详细信息

便秘(constipation)是一种临床常见疾病,发病率逐年上升。大量研究证明补充特定益生菌可以缓解便秘。因此该研究选取3株不同来源的双歧杆菌,研究其对便秘的缓解作用并进一步探究其可能的缓解途径。使用双歧杆菌干预小鼠4周,期间用盐酸洛哌丁胺处理3周构建便秘小鼠模型,通过对小鼠便秘相关指标的检测,确定两歧双歧杆菌CCFM1167对便秘具有较好的缓解作用,并进一步对小鼠便秘相关胃肠调节肽、炎症相关指标和短链脂肪酸进行检测以及相关性分析。结果表明两歧双歧杆菌CCFM1167提升便秘小鼠肠道中短链脂肪酸尤其是乙酸的含量,上调小鼠白细胞介素10及调节性T细胞含量,减轻肠道炎症。推测CCFM1167通过提高便秘小鼠肠道内乙酸的含量,缓解小鼠由洛哌丁胺导致的炎症,提高粪便含水量进而缓解便秘。

关键词：便秘两歧双歧杆菌短链脂肪酸炎症调节性T细胞

两歧双歧杆菌耐渗关键分子机制及制备工艺的研究

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两歧双歧杆菌耐渗关键分子机制及制备工艺的研究

作者：张莹江南大学

学位级别：硕士

两歧双歧杆菌CCFM16具有调节肠道平衡、缓解便秘、改善抑郁症等功效,安全性高,被广泛用于益生菌制剂的开发。渗透胁迫是双歧杆菌高密度培养过程中限制其增殖的主要因素,而两歧双歧杆菌CCFM16耐渗透压能力差,使其产业化应用受到制约。本... 详细信息

两歧双歧杆菌CCFM16具有调节肠道平衡、缓解便秘、改善抑郁症等功效,安全性高,被广泛用于益生菌制剂的开发。渗透胁迫是双歧杆菌高密度培养过程中限制其增殖的主要因素,而两歧双歧杆菌CCFM16耐渗透压能力差,使其产业化应用受到制约。本研究首先将适应性进化技术应用于两歧双歧杆菌CCFM16,筛选获得具有耐高渗透特性的突变菌株,其次通过全基因组比较、候选基因应激表达和三维蛋白结构模拟定位关键突变基因,然后对驯化不同阶段菌株的代谢产物进行比较,找出关键差异物质,提出两歧双歧杆菌CCFM16渗透耐受性的可能机制,最后基于此理论依据,对菌株培养工艺进行优化。本研究揭示了两歧双歧杆菌渗透压耐受提高的关键分子机制,为其高密度培养提供了理论指导。主要研究结果如下:(1)利用适应性进化获得两歧双歧杆菌CCFM16耐渗透压突变株。通过连续增加液体培养基的渗透压进行逐级传代驯化,在700 m Osm/kg、1000 m Osm/kg、1300m Osm/kg固体平板上筛选得到耐渗透压突变株CCFM16-700、CCFM16-1000和CCFM16-1300,对其进行耐渗性分析。结果表明,CCFM16-1300在渗透压为1300m Osm/kg(3.0%Na Cl)培养基中生长速率是原始菌株CCFM16的3倍,且耐渗透压能力能稳定遗传。(2)利用全基因组重测序技术筛选突变株中与渗透压耐受性相关的突变基因。由Illumina Hi Seq平台完成3株耐受不同渗透压的突变株的基因组重测序,对其基因组进行逐一比对,共有20个SNP注释到基因组上,其中13个基因编码的氨基酸发生改变,6个突变的氨基酸处于功能域内。其中基因ccfm16＿290、ccfm16＿1673、ccfm16＿1898的表达与渗透应激表现出高度一致性,编码的蛋白分别和谷氨酰胺的代谢、谷氨酸转运、以及谷氨酸合成有关。对突变前后的基因进行3D蛋白结构模拟预测发现并未引起结构损伤。(3)通过代谢组学进一步确定耐渗透压的关键分子调控机制。对不同驯化阶段的突变菌株进行代谢组学分析,并比较代谢产物。结果表明,差异代谢物主要为糖类和氨基酸,并且随着驯化的进行,胞内葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖和木糖的积累都有不同程度的减少,但“双歧途径”的关键酶活却随生长削弱而增强。与之相反的是除瓜氨酸含量减少外,其他关键差异氨基酸含量均呈增加趋势,其中脯氨酸增加最为显著。此外,当渗透应激增加到一定程度,谷氨酸积累开始减少,且关键突变基因均与谷氨酸合成或转运相关,说明在长期的高渗透胁迫下,突变菌株进化出了一种由谷氨酸合成脯氨酸的渗透保护系统,并且以牺牲基础代谢来提供能量。(4)验证耐渗透压调控途径的激活对菌株生长的影响。对两歧双歧杆菌CCFM16进行基因组分析,结果表明其不具备脯氨酸转运系统,但具有较为完善的肽转运和水解体系。合成含有脯氨酸的二肽、三肽和九肽,发现二肽FP(Phe-Pro)的添加,能够使两歧双歧杆菌CCFM16的生长密度和冻干存活率分别提升15.74%和32.48%,但三肽VPY(Val-Pro-Tyr)的添加并无明显效果,这说明含有脯氨酸的多肽有助于菌株的生长但具有选择性。(5)两歧双歧杆菌CCFM16最适培养工艺。通过比较不同氮源和微量元素对菌株增殖效率的影响,优化出最适底物和限制性微量元素,并基于生长抑制因素优化底物浓度、比例和培养工艺条件。优化结果为:30 g/L葡萄糖、26 g/L胰酪蛋白胨、0.26 g/L Mg SO·7HO、1 m L/L吐温80、1 g/L半胱氨酸盐酸盐,恒p H 6.5培养18 h的最高活菌数达(3.70±0.61)×10 CFU/m L,是MRS培养基恒p H分批培养的3倍。通过酶解酪蛋白得到富含脯氨酸的多肽混合物,在培养8 h时以5 g/L添加,发酵液最高活菌数可以达到(5.75±0.13)×10CFU/m L,冻干存活率达到59.77%,分别比不添加提高了55.40%和27.38%。

关键词：两歧双歧杆菌适应性进化渗透压全基因组重测序脯氨酸培养工艺

基于多位点序列分型对新疆伊宁学龄儿童肠道两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)群体遗传差异解析

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微生物学通报 2023年第12期50卷 5487-5504页

作者：金之烜王平张雪玲田丰伟倪永清石河子大学食品学院新疆石河子832003 江南大学食品学院江苏无锡214122

【背景】两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)是专性代谢人体母乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)和宿主肠道黏膜上皮黏蛋白聚糖的肠道共栖益生菌,对生命早期健康和发育至关重要,目前对其不同人群来源的群体遗传报道较少。... 详细信息

【背景】两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)是专性代谢人体母乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)和宿主肠道黏膜上皮黏蛋白聚糖的肠道共栖益生菌,对生命早期健康和发育至关重要,目前对其不同人群来源的群体遗传报道较少。【目的】探究在有限地域内遗传、饮食相近人群来源的***菌株集的遗传结构是否具有族群特异的规律性,为开发个性化的益生菌株提供理论基础。【方法】对来自新疆伊宁两个族群(维吾尔族和哈萨克族)学龄儿童队列的肠道两歧双歧杆菌进行分离和鉴定,共获得115个菌株,对基于细菌基因组重复序列PCR(repetitive sequence-PCR,rep-PCR)方法筛选的53株代表菌株采用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行群体遗传差异分析。【结果】53株代表菌株共分为37个序列型(sequence type,ST),具有很高的遗传多样性;其中26株源自维吾尔族儿童的菌株有17个ST,而20个ST来自27株哈萨克族儿童的菌株,两个族群来源的菌株之间检测到较少的同源基因重组事件。goeBURST分析显示,来自同一族群的***分离株比来自另一族群的菌株更有可能被归入特定的系统发育分支或克隆复合体(clonal complexes,CC)。【结论】不同族群来源的***分离株显示出较高的遗传多样性,群体遗传结构一定程度上呈现出民族族群来源的特异性,需要更大规模的取样证实。为进一步开展体内外实验并筛选针对区域族群的特色优良益生菌株提供了理论基础。

关键词：两歧双歧杆菌多位点序列分型遗传多样性克隆复合群持家基因

两歧双歧杆菌胞外多糖对胃癌细胞及端粒酶逆转录酶的影响

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微生物学报 2009年第1期49卷 117-122页

作者：陈旭江虹锐杨艳梅刘宁东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030 哈尔滨医科大学肿瘤研究所哈尔滨150040

【目的】研究从双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)提取的细胞表面成分胞外多糖(Exopolysaccharide,***)对人胃癌细胞BGC-823的生长抑制作用及对端粒酶限速因子hTERT活性的影响。【方法】将3种不同浓度***体外作用于胃癌... 详细信息

【目的】研究从双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)提取的细胞表面成分胞外多糖(Exopolysaccharide,***)对人胃癌细胞BGC-823的生长抑制作用及对端粒酶限速因子hTERT活性的影响。【方法】将3种不同浓度***体外作用于胃癌细胞BGC-823,MTT法检测细胞生长抑制率并辅以形态学观察;异硫氰酸盐(FITC)联合PI染色,通过流式细胞术检测肿瘤细胞初期调亡情况;肿瘤细胞端粒酶限速因子hTERT mRNA经RT-PCR检测***对端粒酶活性抑制作用;通过荧光分光光度计显示***对胃癌细胞作用后胞内Ca2+含量变化。【结果】经过检测发现,***对人胃癌细胞BGC823的生长显著抑制(P<0.05)呈剂量时间反应关系;细胞中hTERT mRNA在***的作用下表达降低(P<0.05),有一定剂量效应关系;随着***对肿瘤细胞的抑制,细胞内Ca2+含量显著增加(P<0.05)。【结论】***诱导人胃癌细胞BGC-823调亡的机制可能与改变肿瘤细胞端粒酶限速因子hTERT mRNA表达量和细胞内钙离子浓度有关。

关键词：两歧双歧杆菌胞外多糖胃癌细胞凋亡 hTERT