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时珍国医国药 2019年第3期30卷 615-618页

作者：靳贝贝周晓樊东升任桦山西中医药大学中药学院山西晋中030619 山西中医药大学中西医结合医院山西太原030006

目的建立PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化HPLC法测定两头尖多糖的单糖组成,并结合聚类分析法、主成分分析法(PCA)建立两头尖多糖指纹图谱评价体系。方法采用Diamonsil C_(18)色谱柱(200mm×4.6mm,5μm),以0.05 mol/L磷酸盐缓冲... 详细信息

目的建立PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化HPLC法测定两头尖多糖的单糖组成,并结合聚类分析法、主成分分析法(PCA)建立两头尖多糖指纹图谱评价体系。方法采用Diamonsil C_(18)色谱柱(200mm×4.6mm,5μm),以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(NaH_2PO_4-Na_2HPO_4,pH 6.8)-乙腈(83:17,V/V)为流动相进行洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30℃,检测波长为250nm。通过对12批两头尖多糖样品进行测定,采用国家药典委员会"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"和聚类分析辅助手段计算相似度等相关参数;并运用PCA法对指纹图谱进行统计分析,以各主要色谱峰的保留时间和峰面积为变量建立得分图和载荷图,并用对照品指认色谱峰。结果建立了两头尖多糖指纹图谱共有模式,标定了10个共有峰,并指认了其中的7个共有峰,分别为D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-岩藻糖,12批两头尖多糖的相似度为0.890～0.978。PCA结果表明,前3个成分的累计贡献率达到87.973%,选择这3个因子即可对两头尖多糖进行综合评价。结论将HPLC指纹图谱结合聚类分析、主成分分析进行模式识别对两头尖多糖质量控制是一种有效的评价方法。

关键词：两头尖多糖柱前衍生化高效液相色谱法指纹图谱聚类分析主成分分析

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两头尖多糖提取、纯化及对肝癌HepG-2细胞抗肿瘤活性研究

两头尖多糖提取、纯化及对肝癌HepG-2细胞抗肿瘤活性研究

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作者：闫攀凤山西中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过对两头尖多糖的水提醇沉工艺的研究、分离纯化、单糖组成的研究及体外抗肿瘤活性的研究,为研究两头尖结构、生物活性及其应用开发等提供进一步科学依据。方法:采用水提醇沉法提取两头尖多糖,利用正交实验得出两头尖多糖最佳提... 详细信息

目的:通过对两头尖多糖的水提醇沉工艺的研究、分离纯化、单糖组成的研究及体外抗肿瘤活性的研究,为研究两头尖结构、生物活性及其应用开发等提供进一步科学依据。方法:采用水提醇沉法提取两头尖多糖,利用正交实验得出两头尖多糖最佳提取工艺;通过DEME-52柱分离方法,通过透析得到两头尖多糖各组分(0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L),用苯酚-硫酸法测定多糖的含量,并利用高效液相色谱法对两头尖多糖的单糖组成种类进行了检测;运用MTT法对两头尖多糖进行了体外抗肿瘤活性研究;采用AO-EB双染色荧光显色法来观察两头尖多糖对肝癌细胞HepG-2的凋亡作用;运用流式细胞仪来检测两头尖多糖对肝癌细胞HepG-2的凋亡作用的影响。结果:两头尖多糖的最佳水提工艺条件为:料液比1:15,提取时间1.5h,提取次数3次,两头尖多糖的最佳醇沉工艺为:醇沉浓度70%、醇沉次数为3次,静置时间为12小时;通过高效液相色谱法分析两头尖多糖中单糖组成,结果显示:两头尖多糖由D-葡萄糖、D-核糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖)组成,多糖中含上述各成分的摩尔比为0.97:0.49:0.67:2.31:7.37:0.82;MTT法对两头尖多糖进行体外抗肿瘤活性研究的结果表明,两头尖多糖对人肝癌细胞有一定的抗肿瘤活性,并具有显著的量效关系;AO-EB双染色荧光显色法可以从形态学观察到不同浓度的两头尖多糖对肝癌细胞凋亡的影响,随着浓度的增加,细胞逐渐凋亡,由正常的细胞结构逐渐转化为橙红色圆状或固缩状,团块状的凋亡的细胞,并且细胞数量也有所减少.流式细胞术检测了两头尖多糖对肝癌HepG-2细胞的凋亡作用,随着所加入的两头尖多糖溶液浓度的增加,细胞逐渐凋亡,细胞凋亡数增加。结论:通过单因素和正交试验得出两头尖多糖的最佳提取工艺,通过DEAE-52柱分离法与透析法对两头尖多糖进行纯化,利用高效液相色谱法测出两头尖多糖的单糖组成成分,MTT实验、AO-EB双染色荧光显色法、流式细胞术结果显示两头尖多糖对肝癌细胞HepG-2有一定的抑制作用,可促进细胞的凋亡。上述结果,可以为两头尖多糖进一步的研究与开发、利用奠定基础。

关键词：两头尖多糖单糖提取纯化高效液相色谱法抗肿瘤活性

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两头尖多糖的初步研究

两头尖多糖的初步研究

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作者：王寅鹏长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过对两头尖多糖的提取、分离纯化工艺、单糖组成及体外活性的研究,为进一步研究其化学结构、生物学活性及应用开发提供依据。方法:水提醇沉法提取两头尖多糖;通过比较Sevage法和酶解-Sevage法的去蛋白效果,选出适合于两头尖... 详细信息

目的:通过对两头尖多糖的提取、分离纯化工艺、单糖组成及体外活性的研究,为进一步研究其化学结构、生物学活性及应用开发提供依据。方法:水提醇沉法提取两头尖多糖;通过比较Sevage法和酶解-Sevage法的去蛋白效果,选出适合于两头尖多糖的去蛋白工艺;通过对活性炭法和D941大孔树脂两种脱色方法的比较,确定两头尖多糖的最佳脱色方法;采用透析、分级醇沉及活性炭柱层析等分离方法得到两头尖多糖AP-Ⅰa、AP-Ⅱa～AP-Ⅱd等组分,用苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑法测定各组分的多糖及糖醛酸含量,并用气相色谱法对各部分多糖的单糖组成种类进行了检测;将AP-Ⅰa进行红外光谱扫描,以初步判断其结构;运用MTT法对两头尖多糖各组分进行了体外抗肿瘤活性研究。结果:两头尖多糖最佳水提工艺条件为:料液比1:20,提取温度100℃,提取时间2h,最佳醇沉工艺为:醇沉浓度80%、醇沉2次,静置12小时;通过比较发现酶解-Sevage法是一种较好的去蛋白方法;通过对两种脱色方法的比较,确定脱色最佳方案为D941大孔树脂法;两头尖多糖AP-Ⅰa、AP-Ⅱa～AP-Ⅱd的多糖含量分别为: 86.79%、39.22%、39.98%、42.47%、41.08%,糖醛酸含量分别为:10.90%、7.38%、6.85%、8.61%、10.21%;通过气相色谱法分析各组分中单糖组成,结果显示:AP-Ⅰa和AP-Ⅱc中含鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖;AP-Ⅱa中含鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖,半乳糖;AP-Ⅱb中含鼠李糖、葡萄糖;AP-Ⅱd中含鼠李糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖;对AP-Ⅰa的红外光谱结果进行初步分析,判断其为α-型和β-型端基差向异构共存的吡喃环多糖,且含有糖醛酸;MTT法对两头尖多糖各组分进行体外抗肿瘤活性研究的结果表明,两头尖多糖AP-Ⅰa、AP-Ⅱc对人宫颈癌细胞有一定的抗肿瘤活性,并有显著的量效关系。结论:通过正交试验得出两头尖多糖的最佳提取工艺,并确定酶解-Sevage法和D941大孔树脂法为其较好的纯化方法;将多糖进行初步分离,得到AP-Ⅰa、AP-Ⅱa～AP-Ⅱd等5个组分,MTT法结果表明:两头尖多糖AP-Ⅰa、AP-Ⅱc对人宫颈癌细胞有一定的抗肿瘤活性。上述研究结果,为进一步研究两头尖多糖的化学结构、生物学活性及应用开发奠定了基础。

关键词：两头尖多糖提取分离纯化单糖组成抗肿瘤

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两头尖多糖提取纯化及对结肠癌DLD-1细胞药效学作用的研究

两头尖多糖提取纯化及对结肠癌DLD-1细胞药效学作用的研究

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作者：靳贝贝山西中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过对两头尖多糖的提取纯化及指纹图谱和体外抗肿瘤活性研究,对两头尖多糖进行全面质量分析,进一步为两头尖多糖抑制肠癌的物质基础研究及开发与研究提供科学参考。方法:采用水提醇沉法对两头尖多糖进行提取,利用Box-Behnken响应... 详细信息

目的:通过对两头尖多糖的提取纯化及指纹图谱和体外抗肿瘤活性研究,对两头尖多糖进行全面质量分析,进一步为两头尖多糖抑制肠癌的物质基础研究及开发与研究提供科学参考。方法:采用水提醇沉法对两头尖多糖进行提取,利用Box-Behnken响应面法优化两头尖多糖提取工艺;采用活性炭脱色法对两头尖多糖进行脱色,利用Box-Behnken响应面法优化两头尖多糖脱色工艺;采用TCA法对两头尖多糖进行脱蛋白,利用Bo x-Behnken响应面法优化两头尖多糖脱蛋白工艺;对12个产地的两头尖多糖的单糖组成进行了研究并建立了两头尖多糖柱前衍生化指纹图谱,运用主成分分析、聚类分析、典型相关分析等数理统计学方法对数据进行简化精准处理,选择具代表性指标评价不同产地两头尖多糖的质量差异。通过CCK8法测定两头尖多糖对肠癌细胞DLD-1增殖的影响、通过流式细胞术检测两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡的影响、AOEB双染色荧光显色法观察不同浓度的两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡的影响、以RT-PCR检测C-myc、Cyclin D1、MMP2、MMP9相关基因mRNA水平变化情况。结果:两头尖多糖的最佳提取工艺为:液料比10:1,提取时间120 min,提取次数2次,在此条件下两头尖多糖提取率为2.04±0.03%;两头尖多糖最佳脱色工艺为:活性炭添加量7.3%,脱色次数3次,脱色温度90℃,在此条件下两头尖多糖脱色率为97.26±0.91%,可将两头尖多糖溶液完全脱色;两头尖多糖最佳脱蛋白工艺为TCA浓度为20%,反应时间19min,脱蛋白温度52℃,在此条件下两头尖多糖脱蛋白率为94.92±1.64%。通过上述方法对两头尖多糖进行纯化,纯化后分析纯度,纯度达90%以上。建立了两头尖多糖柱前衍生化指纹图谱共有模式,标定了10个共有峰,并指认了其中的7个共有峰,分别为D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-岩藻糖,12个产地两头尖多糖的相似度为0.890.978,表明12个产地两头尖多糖的单糖组成成分一致性较好,均有11个单糖组成,但各成分含量存在差异。聚类分析结果当欧氏距离为20时,12个产地两头尖多糖可聚为2类,S1、S4为一类,其余为一类;当欧氏距离为5时,后者又可聚为2类,S5、S6、S11、S12聚为一类,S2、S8、S3、S7、S9、S10聚为一类。表明PCA结果表明,前3个成分的累计贡献率达到87.973%,选择这3个因子即可对两头尖多糖进行综合评价。通过CCK-8法测定两头尖多糖不同药物浓度、不同作用时间对结肠癌DLD-1细胞增殖的影作用研究中,发现随着药物浓度的增加,结肠癌DLD-1细胞抑制率增加(P两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡率的影响作用研究中,发现细胞凋亡率随着药物浓度的增加而增加。AO-EB双染色荧光显色法观察到不同浓度的两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡的影响结果为随着药物浓度的增加橙色固缩状的细胞明显增加,细胞凋亡数也随之增加(P两头尖多糖溶液后,基因MMP-2、β-catenin、Cyclin D1、C-MYC的相对表达量都有所降低(P两头尖多糖提取、脱色、脱蛋白工艺实测值与回归模型拟合度较好,可用于两头尖多糖的提取、纯化,将HPLC指纹图谱结合聚类分析、主成分分析进行模式识别对两头尖多糖质量控制是一种有效的评价方法。通过CCK-8法、AO-EB双染色荧光显色法、流式细胞术、RT-PCR检测发现两头尖多糖对结肠癌DLD-1细胞有一定的抑制作用。上述研究成果可为两头尖多糖抗肿瘤活性研究提供可靠的科学参考,为多糖的开发与应用奠定基础。

关键词：两头尖多糖 Box-Behnken响应面法柱前衍生化指纹图谱 CCK-8 AO-EB 流式细胞术 RT-PCR

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