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深红螺菌丙酮酸甲酸裂解酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

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深红螺菌丙酮酸甲酸裂解酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

作者：王成华广西大学

学位级别：硕士

将GenBank中公布的丁酸梭菌(Clsotiridium butyriucium，***)中不依赖于辅酶B的新型甘油脱水酶(Glycerol Dehydratase，GD)的氨基酸序列作同源搜索，发现包括深红螺菌(Rhodospirillum rubrum，***)中被注释为丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate fomate-lyase，PFL)在内的丙酮酸甲酸裂解酶家族与之高度相似，氨基酸序列同源比对及对大肠杆菌PFL和丁酸梭菌中GD晶体结构比对结果表明，催化相关功能区序列保守、晶体结构相似、催化机理类似。以深红螺菌Rhodospirillum rubrum DSM467的基因组DNA为模板克隆了被注释为PFL的基因pflB及其激活因子(Pyruvate Formate-lyase Activating Enzyme，PFL-AE)的基因pflA，分别连入pMD18-T载体测序，结果表明与GenBank中公布序列同源性分别为99.9％和100％。生物信息学分析表明，克隆到的核苷酸序列翻译成的氨基酸序列，具有GD和PFL催化功能相关保守区域。推定深红螺菌中PFL具有类似于大肠杆菌PFL或者具备丁酸梭菌中GD相似的催化功能。将成功克隆的pflA和pflB分别插入表达载体pET-30a(+)中，构建了重组表达载体pET30a-pflA和pET30a-pflB，进而构建多顺反子pET30a-pflAB。pET30a-pflB和pET30a-pflAB在*** JM109(DE3)中诱导表达后经SDS-PAGE检测证明工程菌上清液中都含有93kDa的表达蛋白。对含重组质粒的工程菌诱导表达后的上清液分别进行GD和PFL的功能测定，结果表明上清具有PFL酶活。基于生物信息学分析，推定深红螺菌中PFL具有类似于大肠杆菌PFL的甘氨酰自由基催化机理，推断其Gly432和Cys433参与活性中心的形成。通过反向长距PCR技术构建了G432A、C433A和G432A／C433A定点突变突变体，突变体丧失丙酮酸甲酸裂解酶的活性，初步鉴定了深红螺菌中PFL活性中心氨基酸残基，验证了推断的催化机理。

关键词：甘油脱水酶丙酮酸甲酸裂解酶深红螺菌定点突变甘氨酰自由基生物信息学

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大肠杆菌产乙醇关键酶基因克隆及表达研究

大肠杆菌产乙醇关键酶基因克隆及表达研究

作者：何小林中南林业科技大学

学位级别：硕士

生物质乙醇的生产对解决当今社会日益严重的化石能源石油资源短缺以及大气污染问题具有重要意义。利用微生物发酵法生产乙醇是一种有效手段,丙酮酸甲酸裂解酶、乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶等关键酶对微生物发酵生产乙醇具有重要影响,而微生... 详细信息

生物质乙醇的生产对解决当今社会日益严重的化石能源石油资源短缺以及大气污染问题具有重要意义。利用微生物发酵法生产乙醇是一种有效手段,丙酮酸甲酸裂解酶、乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶等关键酶对微生物发酵生产乙醇具有重要影响,而微生物体内关键基因的表达影响这些酶的酶活及酶量。本研究以大肠杆菌K-12中的丙酮酸甲酸裂解酶基因和醛醇脱氢酶基因出发,以固相亚磷酰胺三酯法合成得到了丙酮酸甲酸裂解酶基因和醛醇脱氢酶基因,通过分子克隆手段,合成得到了 pET-pflB-adhE质粒,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到一株产乙醇重组大肠杆菌。并对其产酶的发酵条件、工艺参数及酶学性质进行系统研究,主要结果如下:1.以基因合成技术克隆得到了丙酮酸甲酸裂解酶基因和醛醇脱氢酶基因,将两个基因连接到pUC19质粒上,通过转入到大肠杆菌DH5α中扩大培养方式,以双酶切手段和琼脂糖凝胶回收的方法,回收目的基因,再利用T4DNA连接酶作用于双酶切回收的pET44c+原核表达质粒,得到了 pET-adhE质粒、pET-pflB 质粒和 pET-pflB-adhE 质粒。2.以pET44c+作为大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和醛醇脱氢酶基因表达载体,通过抗性筛选、菌落PCR及重组质粒PCR验证的方式鉴定重组质粒,将带有目的基因的重组pET44c+质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,SDS-PAGE蛋白电泳检测到大小为85 kD和96kD的蛋白条带,与预期目的蛋白分子质量大小相符合,证明基因插入无误。3.以重组大肠杆菌作为发酵菌株,通过五因素五水平的单因素试验,优化获得其发酵产乙醇的工艺参数:pH 8.0、碳氮比为5:3、摇床转速200 rpm、菌株接种量5%、IPTG诱导剂浓度为0.4 mmol/L。并采用响应面实验设计,在发酵培养基中添加葡萄糖至终浓度为25 g/L作为碳源,乙醇产量为11.98 g/L,达到理论产率的93.96%。4.研究了重组大肠杆菌对乙醇耐受性:在pH 8.0、IPTG诱导剂浓度为0.4 mmol/L、菌株接种量为5%的培养条件下,通过补加葡萄糖发酵方式(1.5g/h),重组大肠杆菌对乙醇的最大耐受性达到了 39.28 g/L。5.对重组大肠杆菌发酵产丙酮酸甲酸裂解酶和醛醇脱氢酶的酶学性质进行初步研究,以LB培养基为培养基质,好氧培养12h后转厌氧培养12h,制备粗酶液,测定丙酮酸甲酸裂解酶和醛醇脱氢酶相对酶活力;丙酮酸激酶最适反应温度为35℃,最适pH 8.0;醛醇脱氢酶最适反应温度为35℃,最适反应pH 8.0。丙酮酸甲酸裂解酶的Km值1.94 mmol/L,醛醇脱氢酶的Km值为1.67 mmol/L。1 mmol/L的Fe2+金属离子对丙酮酸甲酸裂解酶酶活力的促进作用最大。

关键词：大肠杆菌生物质乙醇丙酮酸甲酸裂解酶醛醇脱氢酶

新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计

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新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计

作者：杨登峰广西大学

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1,3-丙二醇(1,3-propanediol),简写为1,3-PDO,自从十九世纪被人们发现以来,以其多方面优越的特性,成为人们关注的焦点。正因为如此,1,3-PDO的生产和应用已引起众多世界跨国公司的高度重视,尤其是生物法生产。在生物法合成1,3-PDO的代谢... 详细信息

1,3-丙二醇(1,3-propanediol),简写为1,3-PDO,自从十九世纪被人们发现以来,以其多方面优越的特性,成为人们关注的焦点。正因为如此,1,3-PDO的生产和应用已引起众多世界跨国公司的高度重视,尤其是生物法生产。在生物法合成1,3-PDO的代谢途径中,作为限速酶的甘油脱水酶成为人们研究的核心。2003年,法国的科学家报道了一种全新的甘油脱水酶,完全无需昂贵的辅酶B12参与反应,大幅度的降低了生产成本,加快了生物法工业化生产1,3-丙二醇的步伐。令人惊奇的是,它与已知的所有依赖辅酶B12的甘油脱水酶没有任何的同源性,却与丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate-lyase,PFL)具有高度的同源性。这使得人们有理由相信新发现的甘油脱水酶的催化机理与PFL的催化机理十分的相近甚至是完全相同的。因此,对pfl基因的催化机理的研究就越发显得重要了。人们已经在大肠杆菌中,找到了一个可以代替1,3-丙二醇氧化还原酶基因的yqhD基因,并且已经证实该基因的引入,对1,3-丙二醇的产量有明显的提高。如果再可以在大肠杆菌中得到取代甘油脱水酶的基因,那么对1,3-丙二醇的工业化将会有巨大的推动作用。利用新型甘油脱水酶与大肠杆菌中PFL的同源性,本实验室试图通过理性设计的方法改造出以大肠杆菌基因为基础的具有甘油脱水酶活性的新酶。本研究论文是借助计算机利用定点突变的方法对大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶进行理性设计,从而为揭示新型甘油脱水酶的催化机理以及

关键词：新型甘油脱水酶丙酮酸甲酸裂解酶理性设计定点突变

强化丙酮酸-CO_2途径对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

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应用与环境生物学报 2015年第3期21卷 441-446页

作者：苏江伟方慧英陆信曜宗红李娜诸葛斌诸葛健江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室工业微生物研究中心无锡214122

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在***强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303)的甲酸脱氢酶基因fdh1和***... 详细信息

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中辅酶NADH的有效供给影响1,3-丙二醇的产量和得率,通过在***强化丙酮酸-CO2途径,以提高胞内NADH水平和1,3-丙二醇产量.将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303)的甲酸脱氢酶基因fdh1和***的丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB在***中过表达,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径.结果显示,单独表达fd h1、pfl B和共表达fhd1、pflB基因的克雷伯氏菌与出发菌株相比,胞内NADH含量明显增加,1,3-丙二醇产量分别提高了8%、12%、18%,摩尔转化率分别提高了7.3%、13.2%、19.5%,除乙酸外其他副产物都有不同程度的降低.本研究表明,强化丙酮酸-甲酸-CO2途径提高了NADH的再生效率,促进了1,3-丙二醇的合成.

关键词：克雷伯氏菌甲酸脱氢酶丙酮酸甲酸裂解酶 1,3-丙二醇

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一种基因工程菌代谢丙酮酸能力的检测方法

广西大学学报（自然科学版） 2008年第3期33卷 317-321,332页

作者：王成华蒙建宗韦宇拓黄日波南宁邦尔克生物技术有限责任公司广西南宁530003 南京工业大学制药与生命科学学院江苏南京210009 广西大学生命科学与技术学院广西南宁530004

建立一种快捷的检测基因工程菌代谢丙酮酸能力的方法,对于开展与丙酮酸相关的代谢流研究至关重要.本研究基于丙酮酸与2,4-二硝基苯肼发生羰基化反应的原理,建立了优化的丙酮酸检测体系;研究了葡萄糖等18种代谢相关物质对所建检测体系的... 详细信息

建立一种快捷的检测基因工程菌代谢丙酮酸能力的方法,对于开展与丙酮酸相关的代谢流研究至关重要.本研究基于丙酮酸与2,4-二硝基苯肼发生羰基化反应的原理,建立了优化的丙酮酸检测体系;研究了葡萄糖等18种代谢相关物质对所建检测体系的影响;成功地将之推广到对发酵产物体系的检测中;利用含有丙酮酸甲酸裂解酶基因的大肠杆菌BL21工程菌发酵以丙酮酸为唯一碳源的培养基,结果进一步验证了该检测方法切实可行.

关键词：丙酮酸 2,4-二硝基苯肼基因工程菌丙酮酸甲酸裂解酶羰基化反应

大肠杆菌K-12中PFL家族基因的生物信息学分析

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广西农业生物科学 2005年第1期24卷 18-22,42页

作者：韦宇拓杨登峰黄日波广西大学生命科学与技术学院

从生物信息学角度,利用生物学数据库( Gen Bank、Swiss-Prot、PDB)和分子生物学分析软件VectorNTI8.0 ,对大肠杆菌K-1 2中的多个丙酮酸甲酸裂解酶( pyruvate formate-lyase,PFL)进行序列的比较分析和结构预测,进而分析其活性位点、相关... 详细信息

从生物信息学角度,利用生物学数据库( Gen Bank、Swiss-Prot、PDB)和分子生物学分析软件VectorNTI8.0 ,对大肠杆菌K-1 2中的多个丙酮酸甲酸裂解酶( pyruvate formate-lyase,PFL)进行序列的比较分析和结构预测,进而分析其活性位点、相关保守位点和特殊结构域及序列的二级结构。

关键词：丙酮酸甲酸裂解酶生物信息学序列分析比对结构域