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lncRNA MRAK050699对二氧化硅粉尘诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞上皮-间质转换的影响

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环境与职业医学 2021年第3期38卷 231-237页

作者：高芳瑜刘煊田娣陈溪渊田雪艳焦子铭侯朋邑王发选宁夏医科大学公共卫生与管理学院宁夏银川750004

[背景]矽肺发病机制未明且没有特效治疗方法,长链非编码RNA(lncRNA)在矽肺纤维化进程中或可发挥作用。[目的]探讨lncRNA MRAK050699对SiO_(2)粉尘诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN细胞)发生上皮-间质转换(EMT)过程的影响。[方法]建立... 详细信息

[背景]矽肺发病机制未明且没有特效治疗方法,长链非编码RNA(lncRNA)在矽肺纤维化进程中或可发挥作用。[目的]探讨lncRNA MRAK050699对SiO_(2)粉尘诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN细胞)发生上皮-间质转换(EMT)过程的影响。[方法]建立大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383细胞)与RLE-6TN细胞共培养体外矽肺模型,分为正常组、模型组、敲减对照组、敲减组。采用CCK8法检测NR8383细胞在10、20、40、80、160、320μg·cm^(-2)SiO_(2)粉尘刺激下的活力,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测在0、20、40、80μg·cm^(-2)粉尘刺激下的转化生长因子-β(TGF-β)含量,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测MRAK050699敲减效率。取四个6孔板,在前两个6孔板中正常培养RLE-6TN细胞24 h,后两个6孔板分别培养转染阴性对照病毒的RLE-6TN细胞24 h,和转染敲减MRAK050699病毒的RLE-6TN细胞24 h;同时在另四个6孔板中,插入Transwell小室,正常培养NR8383细胞24 h。NR8383细胞与RLE-6TN细胞铺板比例为1∶2,之后将Transwell小室连同NR8383细胞一同转入RLE-6TN细胞的6孔板中,向后三组共培养体系的Transwell小室中加入40μg·cm^(-2)SiO_(2)粉尘悬液150μL后,四组同时继续培养24 h,取Transwell小室下室的RLE-6TN细胞置于显微镜下观察,使用Western blotting及RT-qPCR法检测E-cadherin、N-cadherin、α-SMA的mRNA和蛋白表达水平。[结果]CCK8、ELISA法结果显示SiO_(2)剂量在40μg·cm^(-2)时,细胞活力下降较为明显且可保证后续实验的有效进行,上清液中TGF-β表达水平是对照组的2.94倍,可用于后续实验;敲减组MRAK050699的表达水平相比敲减对照组明显下调,敲减效率约为50%(P上皮样特征,为多边形、卵圆形且紧密连接。模型组细胞呈现间质样细胞形态,表现为长梭形、纺锤形,并且细胞间隙变宽。敲减对照组与模型组类似,呈现间质细胞形态。而敲减组的细胞基本处于紧密连接状态。各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=28.11、35.72、15.26,P0.05)。[结论]MRAK050699在矽肺纤维化中发挥着重要的作用,可能参与了SiO_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT过程。

关键词：矽肺纤维化长链非编码RNA 肺泡Ⅱ型上皮细胞肺泡巨噬细胞上皮-间质转换

miR-149-5p靶向FGF5调节人口腔鳞状细胞癌细胞凋亡和上皮-间质转换及微管形成

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重庆医科大学学报 2021年第12期46卷 1479-1485页

作者：卢霞王忠朝邓霞范丽苑李文慧成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院口腔科成都610000 西南医科大学附属口腔医院牙周黏膜科庐州646000 西南医科大学附属口腔医院修复科泸州646000

目的:探究miR-149-5p对人口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞凋亡、上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及微管形成的影响及作用机制。方法:miR-149-5p mimic(mimic)和pcDNA-FGF5(FGF5)单转或共转CAL-27细胞系,RT-PCR、Western blot检测FGF5表达;双荧光素酶报告实验验证miR-149-5p和FGF5靶向关系;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测Bax/Bcl-2蛋白表达;观察EMT细胞形态转化,Western blot检测CAL-27细胞上皮标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)及间质标记物N-钙黏蛋白(N-cadherin,N-cad)表达;成管实验检测CAL-27细胞微管样形成能力,Western blot检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达。结果:miR-149-5p mimic能明显抑制CAL-27细胞中FGF5的表达(P=0.000);miR-149-5p mimic能明显减弱FGF5野生质粒的荧光素酶活性(P=0.000);miR-149-5p mimic可明显上调CAL-27细胞凋亡率及Bax/Bcl-2比值(P=0.000),并逆转FGF5过表达导致的细胞凋亡率(P=0.014)及Bax/Bcl-2比值上调(P=0.000)。miR-149-5p mimic抑制EMT细胞形态由圆形到纺锤形转变,并逆向转换FGF5过表达导致的间质样细胞形态。miR-149-5p mimic可上调CAL-27细胞中E-cad的表达(P=0.000)、下调N-cad的表达(P=0.000),逆转FGF5过表达引起的E-cad表达下调(P=0.020)和N-cad表达上调(P=0.000)。miR-149-5p过表达能明显抑制CAL-27细胞微管结节形成(P=0.002),降低VEGF蛋白表达水平(P=0.000),逆转过表达FGF5引起的VEGF表达上调(P=0.000)。结论:miR-149-5p能抑制OSCC细胞的EMT和微管形成能力并促进细胞凋亡,作用机制与靶向抑制FGF5表达有关。

关键词： miR-149-5p 口腔鳞状细胞癌上皮-间质转换微管形成细胞凋亡 FGF5

玫瑰花总黄酮对乳腺增生大鼠上皮-间质转换的影响

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中国医院药学杂志 2016年第16期36卷 1362-1365页

作者：吕操杜丽芬宋红萍华中科技大学同济医学院附属普爱医院湖北武汉430033

目的:探讨玫瑰花总黄酮对实验性乳腺增生大鼠上皮-间质转换(EMT)的影响。方法:通过注射雌激素和孕激素诱导大鼠乳腺增生,观察玫瑰花总黄酮(200和100 mg·kg-1·d-1)给药干预对乳腺组织形态学变化、乳腺fibronectin、α-SMA、Ecadherin、... 详细信息

目的:探讨玫瑰花总黄酮对实验性乳腺增生大鼠上皮-间质转换(EMT)的影响。方法:通过注射雌激素和孕激素诱导大鼠乳腺增生,观察玫瑰花总黄酮(200和100 mg·kg-1·d-1)给药干预对乳腺组织形态学变化、乳腺fibronectin、α-SMA、Ecadherin、collagen-I和TGF-β1表达情况,以及微小RNA(miR)-21和miR-29a/b水平的影响。结果:玫瑰花总黄酮给药能显著改善模型动物乳腺增生的趋势,抑制乳腺组织collagen-I沉积和TGF-β1表达,缓解EMT上皮标记物E-cadherin的缺失以及间质标记物fibronectin和α-SMA等的过度表达,降低miR-21并一定程度恢复miR-29a/b的水平。结论:玫瑰花总黄酮对乳腺EMT发生的程度具有潜在的抑制作用。

关键词：玫瑰花乳腺增生上皮-间质转换

肝癌细胞上皮-间质转换模型的建立与差异性表达微小RNA分子的高通量筛选

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军事医学 2016年第6期40卷 456-459,478页

作者：王海洋曾泉张彪李思霆南雪何丽娟岳文周军年裴雪涛军事医学科学院野战输血研究所干细胞与再生医学研究室北京100850 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心广州510005

目的拟利用转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肝癌细胞发生上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,建立EMT模型。方法在低血清培养条件下,用TGF-β1处理肝癌细胞2～6 d,观察细胞形态变化,采用Western印迹检测EMT典型... 详细信息

目的拟利用转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肝癌细胞发生上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,建立EMT模型。方法在低血清培养条件下,用TGF-β1处理肝癌细胞2～6 d,观察细胞形态变化,采用Western印迹检测EMT典型标志物的表达变化,流式细胞术检测肝癌肿瘤干细胞标志物CD13和Ep CAM的表达变化,并利用微小RNA芯片技术（miRNA chip）筛选和分析TGF-β1处理前后差异表达的miRNA。结果经10 ng/ml TGF-β1诱导2～6 d后,多数细胞形态由上皮样转变为成纤维样,细胞间隙明显增大;Western印迹定量分析结果显示,10 ng/ml TGF-β1处理后,肝癌细胞E-钙黏蛋白（cadherin）表达水平显著性下调;流式细胞术结果显示,CD13和Ep CAM显著性上调;对miRNA芯片结果分析得到35种差异表达比较显著的miRNA,经过生物信息学分析,这些差异表达的miRNA在转录调控中发挥了重要作用。结论在低血清培养条件下,用10 ng/ml TGF-β1处理肝癌细胞2～6 d,细胞发生明显的EMT过程,利用该法可成功建立肝细胞癌的体外EMT细胞模型,在此模型中,可对差异表达的miRNA进行筛选分析和进一步的功能研究。

关键词：癌,肝细胞上皮-间质转换转化生长因子β1 微小RNA

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中国癌症杂志 2014年第4期24卷 252-257页

作者：任春霞赵敏徐娜宋亚琴陈亚萍吕蓓杨恭江苏省无锡市人民医院妇产科江苏无锡214023 山东省交通医院妇产科山东济南250031 复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科复旦大学上海医学院妇产科学系上海200240 复旦大学附属上海市第五人民医院中心实验室复旦大学上海医学院妇产科学系上海200240 复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所复旦大学上海医学院肿瘤学系上海200032

背景与目的：癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）能促进上皮肿瘤的侵袭和转移，细胞因子IL-6在肿瘤间质微环境中可能介导间质和上皮的相互作用，促进肿瘤的侵袭和转移，但其具体机制尚不十分清楚。方法：以宫颈... 详细信息

背景与目的：癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）能促进上皮肿瘤的侵袭和转移，细胞因子IL-6在肿瘤间质微环境中可能介导间质和上皮的相互作用，促进肿瘤的侵袭和转移，但其具体机制尚不十分清楚。方法：以宫颈癌细胞HeLa为研究模型，用ELISA测定宫颈癌CAFs和正常宫颈组织成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs）条件培养基中IL-6的表达；用条件培养基或IL-6分别处理宫颈癌细胞系HeLa；用Western blot测定样品处理前后上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物（如N-Cadherin和Vimentin等）的变化，同时用划痕和transwell小室测定细胞迁移和侵袭能力的变化。结果：CAF中IL-6表达比NF高4～5倍；与对照组相比，用CAF条件培养基或IL-6处理的HeLa细胞间充质细胞标志物Vimentin和N-Cadherin升高，而上皮细胞标志物E-Cadherin和Cytokeratin下降，表明IL-6可以促进细胞的EMT发生；进一步研究发现过量IL-6处理的HeLa细胞中干细胞转录因子Snail 1随STAT3的激活而上升；同时发现过量IL-6处理的HeLa细胞的迁移和侵袭能力大幅增加。结论：CAF在肿瘤微环境中可能通过IL-6/STAT3/Snail通路诱导宫颈癌上皮细胞的EMT转化，从而促进宫颈癌的侵袭和转移能力。

关键词：癌相关成纤维细胞宫颈癌白介素6 上皮-间质转换迁移和侵袭 Interleukin-6

雌激素介导的上皮-间质转换在子宫内膜异位症中的作用

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中国妇幼保健 2013年第15期28卷 2458-2461页

作者：刘杰魏征王茗重庆市西郊医院妇产科 400051

目的:探讨雌激素介导的上皮-间质转换在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法:选择2009年1月～2012年1月在重庆市西郊医院进行手术治疗并诊断为子宫内膜异位症的50例患者作为实验组(EMS组),选择同期健康体检者40例作为对照组。应用免... 详细信息

目的:探讨雌激素介导的上皮-间质转换在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法:选择2009年1月～2012年1月在重庆市西郊医院进行手术治疗并诊断为子宫内膜异位症的50例患者作为实验组(EMS组),选择同期健康体检者40例作为对照组。应用免疫组织化学、Western blot方法检测在位子宫内膜以及异位内膜标本中上皮细胞的标志分子E-cadherin和基质细胞标志分子Vimentin的表达,同时检测血清中雌二醇水平。结果:异位内膜上皮细胞中E-cadherin表达阳性率为20.00%,在位内膜为38.00%,明显低于正常对照组(P上皮细胞中Vimentin的表达阳性率为74.00%,在位内膜为54.00%,明显高于正常对照组(P上皮细胞的标志分子E-cadherin表达降低,而基质细胞标志分子Vimentin表达上调,说明上皮-间质转换过程与子宫内膜异位症发生相关,而且雌激素可能参与了介导子宫内膜上皮细胞发生间质转换的过程。

关键词：子宫内膜异位症上皮-间质转换雌激素

生长因子诱导的鼻咽癌细胞上皮—间质转换过程中的mRNA-microRNA调控网络 ——AmRNA:MicroRNA Regulatory Network in Epithelial-mesenchrymal Transition Induced by Growth Factor in Nasopharyngeal Carcinoma

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生长因子诱导的鼻咽癌细胞上皮—间质转换过程中的mRNA-microRNA...

作者：何威中南大学

学位级别：硕士

[背景和目的]肿瘤患者死因的90%可归因于肿瘤转移。癌细胞的侵袭-转移是一个极其复杂的多步骤过程。上皮-间质转换(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是哺乳动物胚胎发育过程中必需经历的生理过程,它与肿瘤转移的关系近年来成为... 详细信息

[背景和目的]肿瘤患者死因的90%可归因于肿瘤转移。癌细胞的侵袭-转移是一个极其复杂的多步骤过程。上皮-间质转换(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是哺乳动物胚胎发育过程中必需经历的生理过程,它与肿瘤转移的关系近年来成为肿瘤转移领域最大的突破。EMT过程中,上皮细胞失去了细胞-细胞间的黏附结构,极性消失,具有较强的迁移、运动能力,获得了间质细胞的表型。EMT与肿瘤侵袭-转移的关系在绝大多数实体肿瘤中得到明确,为肿瘤转移研究领域带来巨大的变革和机会。研究人员可以利用细胞模型来模拟EMT过程(特别是生长因子诱导的EMT),便捷地研究EMT过程中复杂的调控网络。鼻咽癌是华南地区常见的恶性肿瘤,其中95%以上的鼻咽癌属于低分化癌,复发转移几率大。通过生长因子(如EGF或TGF-β1)诱导构建鼻咽癌细胞的EMT模型,分析EMT过程中mRNA表达谱和microRNA表达谱的变化规律,将有助于理解EMT过程中的分子调控机制,筛选和侵袭-转移相关的标志物,对于鼻咽癌的转移研究具有较重要的基础与临床意义。[方法]利用EGF(终浓度50ng/m1)或TGF-β1(终浓度10ng/m1)处理鼻咽癌细胞HK-136小时,诱导EMT发生。分离细胞RNA,利用基因芯片分别进行mRNA和microRNA表达谱分析。对mRNA表达谱数据进行pathway分析、GO分析、GSEA(基因集富集分析),并分析了EMT过程中EGFR、TGF-β和EMT通路的变化情况。将EGF或TGF-β1调控基因所构成的“特征”与鼻咽癌组织样本的基因表达谱数据进行了相关性分析。对microRNA表达谱数据进行了分析,对差异表达的microRNA分子做了初步的功能分析,并预测其潜在的靶基因。结合差异microRNA和mRNA分子,利用microRNA-靶基因间的对应关系,建立EMT过程中的“microRNA-靶基因-信号通路”网络。[结果]利用EGF或TGF-β1诱导36小时之后,发现鼻咽癌细胞HK-1出现了明显的EMT,对细胞的mRNA和microRNA表达谱产生明显的影响。EGF诱导的EMT过程中,383个基因表达上调,161个下调;8个microRNA上调,4个下调。TGF-β1诱导的EMT过程中,124个基因上调,165个下调;12个microRNA上调,28个下调。EGF和TGF-β1处理组中共同上调的基因多与细胞运动能力相关,共同下调的基因多与细胞周期、细胞分裂相关。差异基因所涉及的信号通路主要是：Jak-STAT信号通路、细胞因子-受体交互作用、Focal adhesion、TGF-β信号通路、凋亡、细胞外基质受体交互作用、ErbB信号通路等。GSEA分析发现EGF所引起的细胞的应激反应与炎症、感染所引起的应激反应具有很大相似性,而TGF-β1主要影响了Tp53和Tp63的靶基因集。另外,EGF主要影响了转录因子IRF、STAT5、HMGIY、 BACH2、HNF4A和E47的靶基因集,而TGF-β1主要影响了转录因子ATF3、SP1、TCF11、AML和AP1的靶基因集。进一步的分析发现,EGF诱导的EMT过程中,主要依赖ETS家族-EGRl调控轴线;而TGF-β1诱导的EMT过程中,主要依赖SMAD转录因子网络。将EGF或TGF-β1调控基因所构成的“特征”与鼻咽癌组织样本的基因表达谱数据进行了相关性分析,发现“EGF特征”对于鼻咽癌发病机制具有促进作用,而“TGF-β特征”对鼻咽癌发病机制不具有促进作用。通过对差异表达microRNA分子的上游DNA序列结合的转录因子及其结合强度进行预测,发现生长因子诱导的EMT过程中,mRNA转录调控体系和microRNA转录调控体系存在明显的差异。结合miRNA芯片和mRNA芯片结果,首次报道了EMT过程中的“microRNA-靶基因-信号通路”网络。生长因子诱导的鼻咽癌细胞EMT过程中,miR-505和miR-1207-5p表达上调;初步的功能分析显示它们具有抑癌基因的特征。miR-505和miR-1207-5p的这种负反馈作用可能是EMT过程中鲁棒性的机制之一。[结论]1.EGF和TGF-β1均可诱导鼻咽癌细胞发生EMT,对细胞的mRNA和microRNA表达谱产生明显的影响。2.EGF诱导的EMT过程中,主要依赖ETS家族-EGR1调控轴线;而TGF-β1诱导的EMT过程中,主要依赖SMAD转录因子网络。3.描绘了EGF和TGF-β1诱导的EMT过程中所存在的“microRNA-靶基因-信号通路”网络。4.生长因子诱导的鼻咽癌细胞EMT过程中,miR-505和miR-1207-5p是鲁棒性的机制之一。

关键词：鼻咽癌上皮-间质转换表皮生长因子转化生长因子 microRNA

血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮—间质转换的调控作用

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血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮—间质转换的...

作者：张文雍南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的我国是一个肝病大国,慢性肝病的发生率相对较高,而肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化的必经病理改变。肝纤维化具有可逆性,因此,尽早地阻断和延缓肝纤维化的发生和发展,在一定程度上能有效地控制肝硬化的形成。探讨肝... 详细信息

研究背景和目的我国是一个肝病大国,慢性肝病的发生率相对较高,而肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化的必经病理改变。肝纤维化具有可逆性,因此,尽早地阻断和延缓肝纤维化的发生和发展,在一定程度上能有效地控制肝硬化的形成。探讨肝纤维化的发生发展机制,寻找有效的抗肝纤维化药物是关系人类生命健康的重大课题,具有重要而深远的临床意义和社会价值。肝纤维化(hepaticfibrosis, HF)是指肝细胞发生坏死时,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞增多,肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)的增生与降解失衡,导致肝脏内纤维结缔组织大量沉积的病理改变。肝纤维化是由多种细胞因子、生长因子和氧化应激等一系列复杂作用的结果。研究发现,在肝损伤过程中,肝内三种细胞即肝细胞、胆管上皮细胞和静息性肝星状细胞(Q-HSC)均可受各种细胞因子的调控发生表型转变,获得肌成纤维细胞(myofibroblast, MFb)特征,表明肝纤维化过程中伴有上皮-间质转换。上皮-间质转换(epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞在形态、结构、粘附及迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。其主要表现为：上皮细胞表型基因如E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调;间质细胞表型基因如波形蛋白(vimentin)表达上调;间质细胞功能基因如Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)表达增强等。肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)是近年来肝纤维化领域的又一研究热点。研究表明,肝内ACE-AngⅡ-AT1R轴与肝纤维化的形成有着密切的联系。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是RAS的重要效应分子,它通过激活肝星状细胞、汇管区的肌成纤维细胞及骨髓源性间质细胞等诸多致肝纤维化的潜力细胞,进而促进肝纤维化的发生和发展。本课题组前期研究发现,AngⅡ可以诱导人肝细胞系(HL-7702)发生上皮-间质转换。因此,本论文通过体外实验进一步观察AngⅡ是否也可以诱导原代大鼠肝细胞发生上皮-间质转换;同时观察AngⅡ作用于大鼠肝细胞系(BRL-3A)后,细胞迁移能力是否发生改变。随着人们对RAS认识的不断深化,逐渐发现了RAS的许多新的组分,如血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素1-7(Ang(1-7))、Ang(1-7)的受体Mas等,它们构成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴,成为RAS的另一重要分支,对ACE-AngⅡ-AT1R轴具有显著的抑制作用。Ang(1-7)在体内外能与AT1R竞争性结合,拮抗AngⅡ的活性,发挥抗纤维化的作用。因此,本论文通过体内和体外实验,观察ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴是否可以抑制AngⅡ的作用,抑制肝细胞上皮-间质转换的发生,发挥抗肝纤维化作用。方法一、血管紧张素转换酶2对血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮-间质转换的体外实验1.血管紧张素Ⅱ诱导大鼠肝细胞发生上皮-间质转换分离培养原代大鼠肝细胞,予不同浓度的AngⅡ刺激原代大鼠肝细胞48h后,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化;分组为：对照组、10-9mmol/L AngⅡ处理组、10-7mmol/L AngⅡ处理组,实验重复3次。分离培养原代大鼠肝细胞,予10-7mol/L AngⅡ分别于24小时、48小时、72小时不同时间点处理原代大鼠肝细胞,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中collagen、vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化;分组为：24小时对照组、AngⅡ处理24小时组、48小时对照组、AngⅡ处理48小时组、72小时对照组、AngⅡ处理72小时组,实验重复3次。AngⅡ刺激大鼠肝细胞系(BRL-3A)48小时后,Transwell侵袭实验法观察细胞迁移能力的改变;分组为：对照组、AngⅡ刺激组,实验重复3次。2.血管紧张素1-7抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转换分离培养原代大鼠肝细胞,予不同刺激处理原代大鼠肝细胞,免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化;分组为：对照组、AngⅡ刺激组、Ang(1-7)刺激组、AngⅡ+Ang(1-7)处理组、AngⅡ+Ang(1-7)+A779处理组,实验重复3次。3.血管紧张素转换酶2抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转换构建lentiACE2慢病毒载体,并转染大鼠肝细胞系(BRL-3A),免疫蛋白质印迹(Western Blot)法检测各组中collage

关键词：血管紧张素Ⅱ 血管紧张素转换酶2 血管紧张素1-7 上皮-间质转换肝纤维

血管紧张素（1-7）通过阻断NOX来源的ROS介导的NLRP3炎症小体/smad信号通路抑制血管紧张素Ⅱ诱导的肝细胞上皮-间质转换

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血管紧张素（1-7）通过阻断NOX来源的ROS介导的NLRP3炎症小体/sma...

作者：张莉莉南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景我国是一个肝病大国,慢性肝病的发生率相对较高。肝硬化是各种慢性肝病经肝纤维化发展而来。肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经病理改变。因此,深入研究肝纤维化的发病机制,尽早地干预肝纤维化的发生和发展,在一定程度... 详细信息

研究背景我国是一个肝病大国,慢性肝病的发生率相对较高。肝硬化是各种慢性肝病经肝纤维化发展而来。肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经病理改变。因此,深入研究肝纤维化的发病机制,尽早地干预肝纤维化的发生和发展,在一定程度上能有效地控制肝硬化。肝纤维化是指在细胞因子、病毒、及氧自由基的刺激下,肝细胞发生凋亡、坏死,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞增多,肝脏中胶原等细胞外基质过度增生,超过其降解的速度,导致肝脏内纤维结缔组织大量沉积的病理改变。近年研究发现,上皮-间质转换(EMT)是肝纤维化发生的又一重要机制。EMT指极性分布的上皮细胞表型发生改变,E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达减少、细胞间紧密连接及粘附连接消失,细胞骨架遭到破坏,获得间质细胞的表型;细胞内“波形蛋白(vimentin)”和“Ⅰ型胶原(CollA1)”表达增多,细胞迁移能力及收缩能力增强。按其生物学作用的不同,EMT可为三种不同的亚型:Ⅰ型EMT主要参与胚胎和器官发育过程;Ⅱ型EMT与伤口愈合及器官纤维化紧密相关;Ⅲ型EMT参与各种肿瘤形成与转移。NADPH氧化酶(NOX)来源的活性氧(ROS)是诱导EMT发生的重要机制。NOX由不同的亚基构成,不同亚基发挥调节作用的方式也不同。Nox1及Nox2主要受到后转录调节机制的控制,例如“基团的磷酸化”。相反,NOX4的活性却不受到这些因素的影响,其活性的变化主要是由其蛋白表达水平的变化所调节的。过氧化氢(H2O2)是ROS的主要组分。ROS可通过激活RhoA及smad通路诱导细胞发生EMT。然而,关于ROS是否能够诱导肝细胞EMT还鲜见报道。炎症小体是导致肝纤维化的新机制。炎症小体是一个细胞质多蛋白复合体,包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、pro-caspase-1。NLRP3炎症小体的激活可促进caspase-1的裂解与激活,进而促使炎症因子例如IL-1β的成熟及释放。NLRP3炎症小体与细胞EMT密切相关,并在肾脏得到证实,并且NLRP3炎症小体在肝细胞中广泛存在。NOX来源的ROS可以激活NLRP3炎症小体。因此,NLRP3炎症小体是否可被肝细胞内ROS激活进而诱导肝细胞EMT呢?肾素-血管紧张素系统(RAS)在肝纤维化的发生及发展过程中发挥着重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要效应分子,具有较强的促氧化作用。新近研究认为AngⅡ可通过激活ROS从而诱导肾小管上皮细胞发生EMT。然而,在肝脏中,关于AngⅡ是否可诱导肝细胞EMT还鲜见报道。有趣的是,ACE抑制剂-captopril,可以抑制caspase-1的活性,该研究结果说明了 AngⅡ对炎症小体具有潜在的激活作用。因此,AngⅡ是否可通过激活NOX来源的ROS从而激活NLRP3炎症小体诱导肝细胞EMT呢?随着对RAS研究的不断深入,RAS的另一重要分支:血管紧张素转化酶Ⅱ-血管紧张素(1-7)-Mas受体轴(ACE2-Ang(1-7)-Mas Axis)受体轴被发现,并且该轴对ACE-AngⅡ-AT1R轴有显著的抑制作用。Ang(1-7)能与Mas受体结合,拮抗AngⅡ的活性,是AngⅡ的内源性阻断剂,并具有较强的抗氧化作用。那么,Ang(1-7)是否可以抑制AngⅡ诱导的肝细胞EMT呢?研究目的本研究通过以下体内外实验,观察Ang(1-7)是否可以通过抑制NOX来源的ROS介导的NLRP3炎症小体/smad通路从而逆转AngⅡ诱导的肝细胞EMT,为肝纤维化的防治提供新的策略。研究方法1 细胞培养人正常肝细胞株(L02)培养在含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640高糖培养基中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内常规传代培养。实验用细胞均为对数生长期细胞。2 实验动物模型构建本研究构建两种动物模型。1.将雄性健康的wistar大鼠随机分为两个组:假手术组及AngⅡ刺激组,每组6只。大鼠皮下均植入微量泵,每个微量泵可持续泵入4周。假手术组持续泵入生理盐水,同时,AngⅡ处理组老鼠按25 mg/kg-1·h-1的速度进行泵注。2.将雄性健康的wistar大鼠随机分为3个组:假手术组,胆管结扎组、胆管结扎+Ang(1-7)治疗组。假手术组老鼠持续泵入生理盐水,并打开腹腔,但不进行胆管结扎;BDL组大鼠持续泵入生理盐水,同时行胆管结扎手术。Ang(1-7)治疗组老鼠采用上述微量泵,以25 mg/kg-1·h-1的速度泵入Ang(1-7)同时行胆管结扎手术。统一于第四周宰杀大鼠,收集新鲜肝脏组织进行检测。3免疫组织化学将切片常规脱蜡至水,采用枸橼酸溶液微波进行修复,中高火10分钟,中低火7分钟,取出后自然冷却至室温。后采用过氧化物酶封闭液进行封闭,清洗后采用3%的BSA进行封闭1h,与相应的一抗Col1A1(1:100,Proteintech),NOX4(1:100,Abcam),

关键词：肝细胞上皮-间质转换氧化应激 NLRP3炎症小体 smad通路血管紧张素Ⅱ 血管紧张素1-7