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整合素相关激酶与上皮—间充质细胞转化在肺纤维化中的作用

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整合素相关激酶与上皮—间充质细胞转化在肺纤维化中的作用

作者：施维华中科技大学

学位级别：硕士

目的:观察整合素相关激酶(ILK)在博莱霉素致小鼠肺纤维化中的动态表达,探讨其在肺纤维化中与上皮-间充质细胞转化(EMT)的关系。方法:复制博莱霉素致小鼠肺纤维化模型。治疗的第28天和40天处死动物取出肺组织,用苏木精-伊红(HE)和Masson... 详细信息

目的:观察整合素相关激酶(ILK)在博莱霉素致小鼠肺纤维化中的动态表达,探讨其在肺纤维化中与上皮-间充质细胞转化(EMT)的关系。方法:复制博莱霉素致小鼠肺纤维化模型。治疗的第28天和40天处死动物取出肺组织,用苏木精-伊红(HE)和Masson-trichrome染色,分别观察实验动物肺炎症和纤维化的程度,以样本碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸的量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ILK mRNA表达、免疫组化检测不同实验组小鼠ILK,并同时检测间充质细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮细胞标记物上皮钙粘附素(E-Cad)的表达。结果:组织学结果显示小鼠肺组织胶原含量在第28天明显增加,肺泡间隔增宽,炎性细胞浸润。第40天达高峰,肺组织紊乱,羟脯氨酸测定动态增高。与正常对照组比较,肺纤维化组在28天和40天中ILK、α-SMA蛋白表达均增高(P 间质纤维化的病情演变过程。 2.整合素相关激酶在小鼠肺纤维化组织中表达增高,提示ILK可能参与了肺纤维化的发病机制,对肺纤维化的发展起促进作用。 3.E-Cad在小鼠肺纤维化组织中表达减少,α-SMA表达增高,说明模型小鼠肺纤维化中出现了EMT。 4.通过ILK的在EMT中的作用特点,推断肺纤维化中ILK可能通过促进EMT的发生进而在肺纤维化的发病机制中起重要作用。

关键词：整合素相关激酶肺纤维化上皮-间充质细胞转化博莱霉素

红细胞生成素对肾小管上皮-间充质细胞转化的抑制作用及其与VEGF表达变化的关系

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北京医学 2010年第4期32卷 270-274页

作者：赵班吴华郑法雷中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院肾内科 100730 卫生部北京医院肾内科

目的探讨红细胞生成素(rHuEPO)对人肾小管上皮细胞(HKC)上皮-间充质细胞转化(EMT)的作用及其与该细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达变化的关系。方法体外培养HKC,以未处理的HKC为阴性对照,以8ng/ml的转化生长因子-β1(TGF-β1)处理的HKC... 详细信息

目的探讨红细胞生成素(rHuEPO)对人肾小管上皮细胞(HKC)上皮-间充质细胞转化(EMT)的作用及其与该细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达变化的关系。方法体外培养HKC,以未处理的HKC为阴性对照,以8ng/ml的转化生长因子-β1(TGF-β1)处理的HKC为阳性对照,以不同浓度(0.1、1.0、10、50、100IU/ml)的rHuEPO与8ng/ml的TGF-β1共同处理HKC,或在不同时间(-24、0、12、24、36h)用同一浓度rHuEPO(100IU/ml)对8ng/ml的TGF-β1处理的HKC进行干预。应用RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和VEGFmRNA转录水平,应用免疫印迹方法检测α-SMA、E钙黏蛋白以及VEGF的蛋白表达水平。结果rHuEPO以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的HKCα-SMAmRNA和蛋白的表达(P细胞E钙黏蛋白的表达(P细胞VEGFmRNA和蛋白的表达(P间依赖性;该作用可能与rHuEPO上调肾小管上皮细胞VEGF的表达有关。

关键词：上皮-间充质细胞转化红细胞生成素转化生长因子-β1 血管内皮生长因子 E钙黏蛋白α-平滑肌肌动蛋白

特发性肺间质纤维化中TGF-β1诱导上皮-间充质细胞转化的研究

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同济大学学报（医学版） 2013年第3期34卷 12-16页

作者：张素霞顾盼闫利娟罗本芳李惠萍易祥华同济大学附属同济医院病理科上海200065 洛阳市第二中医院病理科河南洛阳471003 同济大学附属肺科医院呼吸科上海200433

目的探讨转化生长因子-β1(tansforming growth factor-β1,TGF-β1)在特发性肺间质纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis,IPF)中上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EM T)的作用和机制。方法选择临床-影像-病理诊断的IPF患者25例肺石蜡组织制作组织芯片,应用免疫组化方法检测病灶组织中TGF-β1和β连环蛋白(β-catenin),间质标记物α-SMA、Desmin、Vim和上皮标记物E-cadherin及CK7的分布及表达情况。结果 TGF-β1主要分布于肌纤维母细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞和巨噬细胞,且其在成纤维细胞灶(fibroblast foci,FF)区域内各种细胞中的表达明显高于无FF区域(P上皮细胞膜表达明显减弱(P上皮细胞表达间质标记物Vim,但未发现α-SMA的表达,而无FF区域两者均无表达。结论 TGF-β1和β-catenin有可能通过相互交叉作用诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT,从而参与肺间质纤维化的发生。

关键词：特发性肺间质纤维化上皮-间充质细胞转化转化生长因子-β1

特发性肺间质纤维化中TGF-β1诱导上皮-间充质细胞转化的研究

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同济大学学报(医学版) 2013年第2期 103-103页

作者：张素霞顾盼闫利娟罗本芳李惠萍易祥华同济大学附属同济医院病理科洛阳市第二中医院病理科同济大学附属肺科医院呼吸科

目的探讨转化生长因子-β1(tansforming growth factor-β1,TGF-β1)在特发性肺间质纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis,IPF)中上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用和机制。方法选择临床-影像-病理诊断的IPF患者25例肺石蜡组织制作组织芯片,应用免疫组化方法检测病灶组织中TGF-β1和β连环蛋白(β-catemn),间质标记物α-SMA、Desmin、Vim和上皮标记物E-cadherin及CK7的分布及表达情况。结果 TGF-β1主要分布于肌纤维母细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞和巨噬细胞,且其在成纤维细胞灶(fibroblast foci,FF)区域内各种细胞中的表达明显高于无FF区域(P上皮细胞膜表达明显减弱(P上皮细胞表达间质标记物Vim,但未发现α-SMA的表达,两者在无FF区域均无表达。结论 TGF-β1和β-catemn有可能通过相互交叉作用诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT,从而参与肺间质纤维化的发生。

关键词：特发性肺间质纤维化上皮-间充质细胞转化转化生长因子-β1

白介素-1β诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转化的实验研究

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医学研究杂志 2007年第11期36卷 33-36页

作者：杨汝春鲁盈朱晓玲王永钧杭州市中医院肾病实验室 310007

目的通过白介素-1β(IL-1β)诱导肾小管上皮细胞转化为肾间充质细胞的研究,探讨炎症因子促进肾间质纤维化的作用机制。方法用IL-1β分别刺激小鼠肾小管上皮细胞3天、4天、5天,提取细胞中的蛋白质,采用Western-blotting测定细胞α-SMA、V... 详细信息

目的通过白介素-1β(IL-1β)诱导肾小管上皮细胞转化为肾间充质细胞的研究,探讨炎症因子促进肾间质纤维化的作用机制。方法用IL-1β分别刺激小鼠肾小管上皮细胞3天、4天、5天,提取细胞中的蛋白质,采用Western-blotting测定细胞α-SMA、Vimentin蛋白水平;用IL-1β分别刺激肾小管上皮细胞12h、36h和60h,提取细胞中的总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定α-SMA、Vimentin基因表达水平。结果IL-1β能够诱导肾小管上皮细胞α-SMA、Vimentin蛋白质合成增加,并随着刺激的时间的延长,两种骨架蛋白的蛋白上皮亦增高;同时IL-1β可上调肾小管上皮细胞α-SMA、Vim-entin的基因表达,也有时间依赖性。10ng/mlIL-1β可显著抑制肾小管上皮细胞增生。结论炎症因子IL-1β可通过上调肾小管上皮细胞两种骨架蛋白的蛋白合成和基因表达,诱导肾小管上皮细胞向肾间充质细胞表型发生转化,从而在肾小管间质纤维化发生发展过程中发挥作用。

关键词：白介素-1β 肾小管上皮细胞表型上皮-间充质细胞转化

DNA碱基损伤位点作为新型表观遗传标志在非小细胞肺癌EGFR-TKI治疗耐药中的作用机制研究

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DNA碱基损伤位点作为新型表观遗传标志在非小细胞肺癌EGFR-TKI治...

作者：李世勋中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:DNA碱基主要包含胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A),DNA碱基损伤普遍存在肿瘤细胞内,损伤因子主要包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)、氧化剂、烷化剂及紫外线照射,其中DNA氧化损伤最为频繁。由于鸟嘌呤的... 详细信息

研究背景:DNA碱基主要包含胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A),DNA碱基损伤普遍存在肿瘤细胞内,损伤因子主要包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)、氧化剂、烷化剂及紫外线照射,其中DNA氧化损伤最为频繁。由于鸟嘌呤的8号位碳原子极易受到氧化攻击而形成的8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤(8-oxo-7,8-dihydroguanine,8-oxo-G),因此8-oxo-G是胞内最多的氧化损伤碱基。碱基切除修复(Base Excision Repair,BER)是一种修复细胞DNA氧化损伤的高度保守机制,BER通路中包含有三十多种蛋白。其中8-氧鸟嘌呤糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase,OGG1)识别并切除8-oxo-G形成脱嘌呤脱嘧啶位点(apurinic-apyrimidinic site,AP),然后AP核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease1,APE1)结合并募集下游修复酶对AP位点进行间接切除修复,并通过DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,DNA polβ)恢复其正确的碱基配对。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要亚型,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)靶向治疗目前有效应用于驱动突变阳性患者,然而在晚期转移性非小细胞肺癌中,患者相继出现耐药并且发生肿瘤转移复发。上皮-间充质细胞转化(Epithelial-mesnchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是癌症耐药重要的原因。EMT是通过表观遗传修饰、转录调控、可变剪切和蛋白质亚细胞定位等不同层面调节,期间有2000-3000个基因表达发生改变。CSCs是肿瘤内最难治疗的一个癌细胞亚群,具有自我更新和DNA损伤抗性的能力,可以维持原发性和继发性肿瘤生长。CSCs有很强的参与DNA修复的基因和蛋白质激活网络系统,因此肿瘤干细胞转化是除了EGFR基因二次突变(T790M突变)和EMT之外导致EGFR-TKI耐药的重要原因[8,9]。EMT和CSCs之间也存在密切的联系。APE1是BER通路的关键限速酶,是具有核酸内切酶和氧化还原双功能蛋白酶,OGG1同样是双功能酶。由于AP和8-oxo-G位点分别为APE1和OGG1酶底物,所以我们默认APE1和OGG1在基因组上富集区域代表AP位点和8-oxo-G位点分布。BER蛋白已被证明具有超越DNA修复的作用,在表观遗传中有新的发现。APE1对非B型DNA结构的修复活性减弱导致基因组中存在碱基损伤“热点区域”,8-oxo-G位点亦呈现非随机分布的特点。8-oxo-G/AP位点在全基因组中可以稳定的存在并且呈现出非随机分布的特征。结合大量文献报道APE1和OGG1与肿瘤的复发转移及耐药相关。本研究主要目的是为探索8-oxo-G/AP位点作为一种新型表观遗传标志物在全基因中的分布规律,APE1和OGG1蛋白在修复碱基损伤位点(8-oxo-G/AP位点)的同时偶联基因表达调控,这种双功能特征可能通过表观遗传重编程调控EMT和CSCs相关基因的异常表达促进癌细胞对EGFR-TKI治疗的抵抗。研究方法:1.用Western Blot实验验证APE1抗体和OGG1抗体与A549细胞表达的APE1蛋白和OGG1蛋白高效且特异性的相结合。2.用琼脂糖凝胶电泳技术检测染色质被超声破碎成200bp-1500bp长度的DNA片段是否满足ChIP-seq要求,即60%DNA片段在200bp-1500bp范围内;5%聚丙烯酰胺凝胶电泳,用超高灵敏金染核酸染料(Invitrogen,S11494,美国)进行核酸染色显示APE1、阳性、2%input与阴性对照IP样本在200bp-1500bp之间位置比较有明显的核酸条带,以此来验证Ch IP-seq实验体系是否成功。3.用Ch IP-seq实验技术来获取A549细胞中与APE1和OGG1蛋白特异性结合的AP位点和8-oxo-G位点邻近的DNA片段,并用Ch IP-PCR技术验证整个实验体系的可靠性。4.生物信息学分析Ch IP-seq数据,使用MACS2(version 2.1.0)峰值调用软件来识别背景IP富集的区域。所有数据集的q值阈值均为0.05。峰值调出后的染色体分布、峰宽、褶丰度、显著性水平和每个峰峰数的分布均得到了显示,使用Homer软件检测全新序列模体和已知匹配模体,Ch IPseeker可以确认峰相关基因,

关键词： 8-oxo-G位点 AP位点 APE 非小细胞肺癌 EGFR-TKI 上皮-间充质细胞转化肿瘤干细胞

E2F7在高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT中的作用及白藜芦醇的干预研究

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E2F7在高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT中的作用及白藜芦醇的干预研究

作者：赵俊琳贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨细胞周期相关转录因子E2F transcription factor 7（E2F7）通过调控自噬从而影响高糖诱导的肾小管上皮细胞（NRK-52E）EMT的作用和机制,以及白藜芦醇（resveratrol,Res）是否可以通过介导E2F7的表达上调自噬水平,从... 详细信息

目的:本研究旨在探讨细胞周期相关转录因子E2F transcription factor 7（E2F7）通过调控自噬从而影响高糖诱导的肾小管上皮细胞（NRK-52E）EMT的作用和机制,以及白藜芦醇（resveratrol,Res）是否可以通过介导E2F7的表达上调自噬水平,从而抑制肾小管上皮细胞EMT的发生发展,为糖尿病肾病寻找新的有效的治疗靶点。方法:（1）将24只健康雄性C57-BL/6小鼠随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病模型组（DM组）、白藜芦醇干预组（Res组）,每组各8只。用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）复制1型糖尿病小鼠模型。从糖尿病模型复制成功8周起,Res组连续灌胃给予Res干预12周后处死各组小鼠测定相应生化指标和肾脏指数。HE、Masson染色比较各组肾组织的病理形态学改变;免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）观察各组肾组织E2F7的表达情况;蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测各组E2F7、自噬相关蛋白LC3 II/I、Beclin1以及EMT指标E-cadherin、α-SMA、Snail1及纤维化相关指标Collagen IV的蛋白表达水平,实时荧光定量（real-time PCR）检测Collagen IV、E-cadherin、α-SMA的m RNA表达水平。（2）正常糖（NG）和高糖（HG）培养NRK-52E细胞并于48h后收集细胞蛋白,Western blot分别检测E2F7、Beclin1、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA、Snail1和Collagen IV的表达。免疫荧光（Immuno-fluorescence）检测E-cadherin、α-SMA、E2F7的表达。（3）在NG和HG培养的NRK-52E细胞中分别加入浓度为25μmol/L的Res,培养48h后收集蛋白样本,WB检测E2F7、Beclin1、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA、Snail1和Collagen IV的蛋白表达。（4）在NG和HG培养的NRK-52E细胞中分别转染过表达E2F7质粒（overexpression E2F7 plasmid）和空载质粒（Vector,Vec）,分为NG+Vec组,NG+E2F7组,HG+Vec组和HG+E2F7组,48h后收集细胞蛋白样本,Western blot检测E2F7、Beclin1、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA、Snail1和Collagen IV的蛋白表达水平。（5）在NG和HG培养的NRK-52E细胞中分别转染对照si RNA和E2F7 si RNA并加入浓度为25μmol/L的白藜芦醇,培养48h后收集样本,WB检测E2F7、LC3 II/I、p62以及E-cadherin、α-SMA和Collagen IV的蛋白表达水平。结果:（1）DM组小鼠模型复制成功。与NC组相比,DM组的空腹血糖（FBG）、肾脏指数（KI）、血肌酐（Cr）、24h尿微量白蛋白（UAER）和尿量总蛋白（UTP）均显著增高（P＜0.05）。HE、Masson染色结果表明DM组小鼠肾组织出现了肾纤维化病变。IHC结果显示DM组小鼠肾小管及间质中E2F7阳性棕黄色颗粒表达较NC组减少,并且DM组小鼠肾组织的E2F7、E-cadherin、Beclin1、LC3 II/I蛋白水平较NC组均显著降低（P＜0.05）,α-SMA、Snail1、Collagen IV蛋白水平较NC组均显著升高（P＜0.05）。经Res干预后,除了血糖无显著差异外,Res组中其余生化指标和肾脏指数均显著低于DM组（P＜0.05）;肾纤维化病变明显得到改善;肾组织中E2F7阳性表达增多;E2F7、E-cadherin、Beclin1、LC3 II/I蛋白水平较DM组显著升高（P＜0.05）,而α-SMA、Snail1、Collagen IV蛋白水平较DM组显著降低（P＜0.05）。与DM组比较,Res组的E-cadherin m RNA表达增高（P＜0.05）,α-SMA和Collagen IV的m RNA表达降低（P＜0.05）。（2）（1）与正常糖组（NG）比较,高糖组（HG）NRK-52E细胞中p62、α-SMA、Snail1和Collagen IV蛋白的表达均增加（P＜0.05）,E2F7、E-cadherin、Beclin1和LC3II/I蛋白表达均减少（P＜0.05）。（2）与HG组比较,HG+Res组NRK-52E细胞中E2F7、E-cadherin、Beclin1、LC3 II/I蛋白表达均增加（P＜0.05）,α-SMA、Snail1、Collagen

关键词：糖尿病肾病上皮-间充质细胞转化自噬白藜芦醇 E2F7

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上皮-间质转化与肝纤维化的研究进展

世界华人消化杂志 2014年第20期22卷 2857-2862页

作者：王靖思刘玉琴陈兰羽顾蓓孙桂芝中国中医科学院广安门医院肿瘤科北京市100053 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京市100005 中国中医科学院广安门医院感染病科北京市100053

肝纤维化(hepaitc fibrosis,HF)是"肝炎-HF/肝硬化-肝癌"三部曲中的重要环节,有效控制甚至逆转HF势在必行且任重道远,上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是目前HF领域研究热点,国内外对于其进行了大量体内及... 详细信息

肝纤维化(hepaitc fibrosis,HF)是"肝炎-HF/肝硬化-肝癌"三部曲中的重要环节,有效控制甚至逆转HF势在必行且任重道远,上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是目前HF领域研究热点,国内外对于其进行了大量体内及体外的HF实验研究,现对近年来HF与黏膜进行综述,相信明确研究其相关机制有希望为HF研究提供一定的理论基础.

关键词：肝纤维化上皮-间充质细胞转化

SYT1对肝癌细胞侵袭、转移的影响及其分子机制

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贵州医科大学学报 2020年第8期45卷 869-874,881页

作者：许静喻超杨盛力孙诚谊贵州医科大学附属医院肝胆外科贵州贵阳550004 贵州医科大学肝胆胰脾重点实验室贵州贵阳550004 贵州省肝胆胰脾疾病研究所贵州贵阳550004

目的:研究突触囊泡蛋白Ⅰ(SYT1)对肝癌侵袭转移的影响及其机制。方法:选择人肝癌细胞(Hep3B、Huh7、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404)和人正常肝细胞HL-7702作为研究对象,采用实时荧光定量聚合酶链反应实验(q PCR)检测SYT1在这些细胞... 详细信息

目的:研究突触囊泡蛋白Ⅰ(SYT1)对肝癌侵袭转移的影响及其机制。方法:选择人肝癌细胞(Hep3B、Huh7、HCCLM3、SMMC-7721、HLF和BEL-7404)和人正常肝细胞HL-7702作为研究对象,采用实时荧光定量聚合酶链反应实验(q PCR)检测SYT1在这些细胞中的表达;选取150例原发性肝癌组织及其对应癌旁组织作为研究对象,通过免疫组化实验分析SYT1在这两种组织中的表达;选择肝癌细胞Hep3B、Huh7作为观察对象,根据转染的载体不同分别将其分为对照组(转染表达空载体)、干扰组(转染干扰质粒)和过表达组(转染过表达质粒),通过Transwell迁移实验和OrisTM细胞迁移实验检测SYT1对肝癌细胞迁移能力的影响,通过Transwell侵袭实验检测SYT1对肝癌细胞侵袭能力的影响,采用Western blot实验检测上皮-间充质细胞转化(EMT)相关蛋白钙黏附蛋白E(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达。结果:SYT1的m RNA和蛋白在肝癌组织中的表达高于对应的癌旁组织(P细胞中的表达高于正常肝细胞,Huh7和Hep3B细胞中SYT1的表达高于其他肝癌细胞(P细胞迁移、侵袭能力降低,过表达组的肝癌细胞迁移、侵袭能力增强(P细胞E-cadherin蛋白表达增多,Vimentin蛋白表达量减少(P细胞EMT过程,进而抑制其侵袭、迁移能力。

关键词：肝肿瘤波形蛋白突触囊泡蛋白1 侵袭迁移上皮-间充质细胞转化