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作者：刘临红山西医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,且发病率近年有递增趋势。多药耐药（multidrug resistance,MDR）和肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的产生是影响乳腺癌预后的两大重要因素。乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer r... 详细信息

背景与目的:乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,且发病率近年有递增趋势。多药耐药（multidrug resistance,MDR）和肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的产生是影响乳腺癌预后的两大重要因素。乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP）是新近发现的ABC（ATP binding cassette）家族的膜转运蛋白,已被证实为CSCs标记物之一。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肿瘤转移的主要原因,近年来被证实与CSCs和BCRP介导的MDR密切相关。上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）是新近确立的一种肿瘤相关抗原,可诱导EMT产生。本课题旨在研究EpCAM是否通过诱导EMT促进BCRP介导的乳腺癌的MDR及干性,进而影响乳腺癌的预后。方法:1.米托蒽醌（mitoxantrone,MX;0.04、0.08、0.16 nM）处理乳腺癌MCF-7细胞1周,用Western blot法测BCRP、CSCs标记物、EpCAM、EMT相关蛋白表达水平变化。*** blot法测定乳腺癌敏感株MCF-7、耐药株MCF-7/MX细胞中BCRP、CSCs标记物、EpCAM及EMT相关蛋白表达水平。***-β1（10 ng/ml）和/或TNF-α（10 ng/ml）处理MCF-7细胞6天,Western blot法测EMT相关蛋白、BCRP、EpCAM及CSCs标记物的表达水平。4.设计针对EpCAM的siRNA,靶向干扰MCF-7/MX细胞中EpCAM表达,用Real-time PCR和Western blot法鉴定EpCAM敲低程度后,用MCF-7/MX、阴性对照株MCF-7/MX/siNC、干扰效率大于50%的细胞株MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2进行后续实验。*** blot法测各组细胞BCRP、PCNA、CSCs标记物及EMT相关蛋白的表达。***8法测各组细胞对MX的敏感性。***法实验测各组细胞的迁移和侵袭能力。*** blot法测定MCF-7和MCF-7/MX细胞Wnt通路相关蛋白的表达差异;Wnt通路抑制剂ICG-001（5μM and 10μM）处理MCF-7/MX细胞24 h,Western blot法测定其Wnt通路相关蛋白、EpCAM及CSCs标记物的表达变化。结果:***表达与BCRP介导的乳腺癌细胞的MDR和干性相关。用MX（0.04、0.08、0.16 nM）处理MCF-7细胞1周后,BCRP及CSCs标记物表达升高,EpCAM蛋白表达同步升高;与乳腺癌敏感株MCF-7细胞相比,MCF-7/MX细胞耐药性及干性增强,EpCAM表达明显增多（P＜0.001）。***法成功敲低EpCAM。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞EpCAM变化不明显（P＞0.05）,干扰组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞中EpCAM表达下调大于50%（P＜0.001）。3.敲低EpCAM可逆转BCRP介导MCF-7/MX细胞的MDR。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞BCRP蛋白表达和对MX的敏感性变化不明显（P＞0.05）,敲低组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞中BCRP表达明显减少（P＜0.001）,且对MX的耐药性降低（P＜0.001）。4.敲低EpCAM可致MCF-7/MX细胞干性减弱。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞PCNA和CSCs标记物表达变化不明显（P＞0.05）,EpCAM敲低组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞中上述蛋白表达明显减少（P＜0.001）。***与乳腺癌EMT密切相关,且后者促进BCRP介导的乳腺癌MDR和干性。用TGF-β1（10 ng/ml）和/或TNF-α（10 ng/ml）处理MCF-7细胞6天诱导其发生EMT,EpCAM表达明显上调（P＜0.05,P＜0.01）;TGF-β1组BCRP及干细胞标记物表达水平变化不明显（P＞0.05）,TNF-α和TNF-α+TGF-β1组BCRP及CSCs标记物表达水平均明显升高（P＜0.001,P＜0.0001）。6.敲低EpCAM可减弱MCF-7/MX细胞的迁移和侵袭能力,逆转其EMT发生。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞迁移和侵袭能力及EMT相关蛋

关键词：上皮细胞粘附分子肿瘤干细胞乳腺癌耐药蛋白上皮间质转化 Wnt/β-catenin通路乳腺癌

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E-钙粘蛋白、β-环连蛋白、上皮细胞粘附分子在宫颈鳞状细胞癌癌变过程中的表达

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中国妇幼保健 2008年第1期23卷 79-81页

作者：姜梅芳朱继红苏文英刘瑞娟王春艳赵群恩河北省保定市第一中心医院 071000

目的:探讨细胞粘附分子E-钙粘蛋白、β-环连蛋白、上皮细胞粘附分子在宫颈鳞状细胞癌癌变过程中的表达和意义。方法:通过免疫组织化学方法检测3种细胞粘附分子在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈鳞状细胞癌中的表达情况。结果:... 详细信息

目的:探讨细胞粘附分子E-钙粘蛋白、β-环连蛋白、上皮细胞粘附分子在宫颈鳞状细胞癌癌变过程中的表达和意义。方法:通过免疫组织化学方法检测3种细胞粘附分子在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈鳞状细胞癌中的表达情况。结果:①E-钙粘蛋白的阳性表达率从正常宫颈鳞状上皮、CIN至宫颈鳞状细胞癌逐渐下调;②β-环连蛋白的异常表达率从正常宫颈鳞状上皮、CIN至宫颈鳞状细胞癌逐渐增高;③上皮细胞粘附分子的过表达率从正常宫颈鳞状上皮、CIN至宫颈鳞状细胞癌逐渐增高;④E-钙粘蛋白的阳性表达下调及β-环连蛋白的异常表达与上皮细胞粘附分子的过表达相关,可能在宫颈癌变过程中起协同作用。结论:E-钙粘蛋白、β-环连蛋白、上皮细胞粘附分子参与了宫颈鳞状细胞癌的恶性转化过程,可做为宫颈鳞状细胞癌癌变过程中的分子生物学指标。

关键词：宫颈鳞状细胞癌宫颈上皮内瘤变 E-钙粘蛋白 β-环连蛋白上皮细胞粘附分子免疫组织化学

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靶向上皮细胞粘附分子单域抗体的筛选及其表达纯化

靶向上皮细胞粘附分子单域抗体的筛选及其表达纯化

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作者：张伟雄暨南大学

学位级别：硕士

目的:通过筛选噬菌体单域抗体文库,获得靶向上皮细胞粘附分子的单克隆单域抗体,并对候选单域抗体进行表达纯化,为今后将这些单域抗体用于癌症治疗奠定基础。方法:1.制备噬菌体单域抗体文库;2.选择可应用于后续淘选实验的抗原片段,并对... 详细信息

目的:通过筛选噬菌体单域抗体文库,获得靶向上皮细胞粘附分子的单克隆单域抗体,并对候选单域抗体进行表达纯化,为今后将这些单域抗体用于癌症治疗奠定基础。方法:1.制备噬菌体单域抗体文库;2.选择可应用于后续淘选实验的抗原片段,并对其进行分析和合成;3.使用合成的上皮细胞粘附分子抗原片段对此文库进行5轮筛选;4.从第5轮筛选的单域抗体文库中随机挑取单克隆噬菌体抗体,检测其与抗原的结合;5.检测获得的单克隆噬菌体单域抗体与抗原结合的特异性及其DNA序列;6.检测获得的噬菌体单域抗体与完整的上皮细胞粘附分子的结合;7.对单域抗体进行蛋白表达纯化和鉴定。结果:1.成功地制备了噬菌体单域抗体文库,其滴度为4.4 X 1013 pfu/ml;2.选择了上皮细胞粘附分子基因第二个外显子编码的一段多肽作为抗原片段,并成功合成纯度达95%以上的抗原片段;3.完成了噬菌体单域抗体文库的5轮筛选;4.随机挑取和检测了478个单克隆噬菌体单域抗体,从中获得了30个候选单域抗体;5.通过进一步鉴定从中获得了17个单域抗体,分析其DNA序列,排除重复的序列后,获得5个不同的单域抗体;6.其中得到3个单克隆噬菌体单域抗体能够与完整的上皮细胞粘附分子结合;7.成功地表达和纯化了5个单域抗体,这些纯化的单域抗体能够与合成的抗原片段和完整的上皮细胞粘附分子结合。结论:本研究最终获得了5个单克隆噬菌体单域抗体,成功地表达和纯化了这些单域抗体,且获得的单域抗体能够与完整的上皮细胞粘附分子结合。

关键词：癌症干细胞单域抗体上皮细胞粘附分子

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抗EpCAM单克隆抗体治疗肝母细胞瘤的动物实验研究

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临床小儿外科杂志 2019年第1期18卷 63-68页

作者：陈立才李朋飞黄一敏刘江斌吕志宝上海交通大学附属儿童医院普外科上海市200062 郑州大学附属儿童医院普外科河南省郑州市471003

目的观察抗上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)单克隆抗体靶向治疗人肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)荷瘤鼠模型的疗效。方法体外培养HB HuH-6细胞,采用免疫组化检测Hu H-6细胞中EpCAM的表达。将10只裸鼠皮下接... 详细信息

目的观察抗上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)单克隆抗体靶向治疗人肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)荷瘤鼠模型的疗效。方法体外培养HB HuH-6细胞,采用免疫组化检测Hu H-6细胞中EpCAM的表达。将10只裸鼠皮下接种HuH-6细胞,待建立稳定的HuH-6细胞荷瘤鼠模型后,将荷瘤鼠等额随机分为两组:实验组经鼠尾静脉注射抗EpCAM单克隆抗体,剂量30 ug/kg,每天1次;对照组经鼠尾静脉注射等量生理盐水;两组均给药3周。停药1周后取荷瘤鼠肿瘤组织进行病理检查,测算肿瘤的重量及体积,并计算抑瘤率。结果 HuH-6细胞传代培养成功,免疫组化染色可见其细胞膜EpCAM呈阳性表达。裸鼠接种Hu H-6细胞6周后可形成肿瘤体,病理检查证实为HB,成功建立HB荷瘤鼠模型。实验组肿瘤重量及体积分别为(35. 6±2. 97) mg和(1. 12±0. 09) cm^3,对照组肿瘤重量及体积分别为(45. 8±4. 59) mg和(1. 37±0. 77) cm^3,差异均有统计学意义(P <0. 05)。实验组肿瘤组织EpCAM表达阳性率(28. 3±5. 4)%,对照组肿瘤组织EpCAM表达阳性率(39. 7±4. 4)%,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论动物实验结果表明,抗Ep CAM单克隆抗体能够抑制HB荷瘤裸鼠肿瘤的生长,为HB靶向治疗提供了一定的实验基础和理论依据。

关键词：肝母细胞瘤上皮细胞粘附分子抗体,单克隆靶向治疗模型,动物

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EpCAM在小儿肝母细胞瘤中的表达及其临床意义

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中华小儿外科杂志 2018年第5期39卷 340-344页

作者：李朋飞黄一敏吕志宝刘江斌上海市儿童医院、上海交通大学附属儿童医院普外科 200062

目的免疫组化染色检测EpCAM在小儿肝母细胞瘤（hepatoblastoma,HB）中的表达,探讨其表达与HB各临床病理参数的关系及其意义.方法回顾性分析上海交通大学附属儿童医院2010年1月至2015年4月间收治的病理证实为HB的患儿共31例,其中随访... 详细信息

目的免疫组化染色检测EpCAM在小儿肝母细胞瘤（hepatoblastoma,HB）中的表达,探讨其表达与HB各临床病理参数的关系及其意义.方法回顾性分析上海交通大学附属儿童医院2010年1月至2015年4月间收治的病理证实为HB的患儿共31例,其中随访资料完整的共26例.采用Elivision两步法免疫组化技术检测26例HB肿瘤组织EpCAM蛋白的表达情况,并探讨EpCAM的表达与HB患儿年龄、性别、PRETEXT分期、AFP水平、病理类型等参数的关系.计量资料采用x2检验,计数资料采用t检验,Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,应用breslow进行差异性检验,所有统计学分析均采用SPSS22软件进行.结果 26例HB患儿,男19例,女7例,年龄6～108个月（中位年龄27.2个月）.所有患儿采用PRETEXT分期方法进行分期,其中Ⅰ期3例,Ⅱ期5例,Ⅲ期13例,Ⅳ期5例.术前AFP＞1 000 ng/ml共22例,＜1000 ng/ml共4例.术后病理提示单纯胎儿型6例,混合型16例,胚胎型4例.其中19例（73.1％）呈EpCAM阳性表达,7例（26.9％）为阴性表达.EpCAM在HB组织中阳性表达主要位于细胞膜,部分弥散至胞浆.PRE-TEXTⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期HB患儿的2年总生存率（overall survival rate,OS）分别为：（66.7±2.7）％,（80.0±17.9）％,（42.3±16.5）％,（60.0±21.9）％.EpCAM阳性患儿和阴性患儿2年OS为分别48.4％和80.0％（P＜0.05）.EpCAM的表达情况与患儿年龄、性别、术前AFP水平、分期、病理类型无明显相关性（均P＞0.05）.结论 EpCAM在大部分HB中均有表达,其表达与患儿的年龄、性别、肿瘤分期、病理类型无明显相关性,但EpCAM阴性患儿2年OS显著高于EpCAM阳性患儿.表明EpCAM的表达与其HB患儿的预后有一定的相关性,可成为小儿HB的肿瘤标志物之一,并有可能成为HB靶向治疗的潜在靶点之一.

关键词：肝胚细胞瘤上皮细胞粘附分子免疫组织化学

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抗体免疫脂质磁球法检测肺癌循环肿瘤细胞初探

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中国呼吸与危重监护杂志 2016年第2期15卷 147-152页

作者：肖华陈思张伟陆乘俊梁晓飞沈鹤柏金海吴俊杰李强第二军医大学长海医院呼吸与危重症医学科上海200433 第二军医大学长海医院胸心外科上海200433 上海柏慧康生物科技有限公司上海201900 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室/现代人类学教育部重点实验室上海200433

目的初步探索抗体免疫脂质磁球法在肺癌循环肿瘤细胞(CTCs)检测中的应用。方法采用反向蒸发法制备上皮细胞粘附分子(Ep CAM)和表皮生长因子受体(EGFR)抗体免疫脂质磁球。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)和外周血肺癌CTCs模型中,评价Ep CAM和EGFR... 详细信息

目的初步探索抗体免疫脂质磁球法在肺癌循环肿瘤细胞(CTCs)检测中的应用。方法采用反向蒸发法制备上皮细胞粘附分子(Ep CAM)和表皮生长因子受体(EGFR)抗体免疫脂质磁球。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)和外周血肺癌CTCs模型中,评价Ep CAM和EGFR抗体免疫脂质磁球对A549细胞的捕获效率;在此基础上,用上述两种抗体免疫脂质磁球法检测肺癌患者外周血中CTCs;并将Ep CAM免疫脂质磁球法与CellsearchTM系统进行比较。结果 Ep CAM和EGFR免疫脂质磁球法在PBS溶液CTCs模型中对A549细胞的中位检出率分别为92%和90%,在外周血模型中分别为85%和81%;两种磁球法在13例肺癌患者中均检测出了CTCs,中位检出个数均为5个,而在健康对照者中中位检出个数均为0个(P<0.05)。用Ep CAM免疫脂质磁球法和CellsearchTM系统检测3例肺癌患者的CTCs,前者对其中2例患者的CTCs检出量高于后者,另外1例相等。结论 Ep CAM和EGFR免疫脂质磁球法均能有效检出肺癌CTCs,两种磁球法检出率相当。Ep CAM免疫脂质磁球法对肺癌患者CTCs检出量有高于CellsearchTM系统的趋势。

关键词：肺癌循环肿瘤细胞上皮细胞粘附分子表皮生长因子受体免疫脂质磁球

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EpCAM在小儿肝母细胞瘤中的表达、临床意义及其单克隆抗体靶向治疗的实验研究

EpCAM在小儿肝母细胞瘤中的表达、临床意义及其单克隆抗体靶向治...

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作者：李朋飞（Lee pengfei）上海交通大学

学位级别：硕士

肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)是小儿最常见的肝脏恶性肿瘤,近年来,随着对小儿HB的发生、发展认识的加深与综合治疗的广泛开展,小儿HB的治疗效果得到了显著提高。但是,晚期或有远处转移的HB患儿的病死率仍较高,尤其对某些HB复发与转移... 详细信息

肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)是小儿最常见的肝脏恶性肿瘤,近年来,随着对小儿HB的发生、发展认识的加深与综合治疗的广泛开展,小儿HB的治疗效果得到了显著提高。但是,晚期或有远处转移的HB患儿的病死率仍较高,尤其对某些HB复发与转移的病例治疗还相当棘手,严重影响患儿预后。随着现代分子生物学的发展,生物靶向治疗已经成为肿瘤研究与临床治疗的热点。但小儿恶性实体肿瘤的靶向治疗目前尚处于起步阶段。尤其是针对小儿HB的靶向治疗的研究与应用文献甚少。研究证实,EpCAM(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)的表达多见于成人上皮来源恶性肿瘤,且其高表达与肿瘤的预后明显相关。但EpCAM表达与小儿实体肿瘤的关系研究还不多见。现在EpCAM单克隆抗体已进行了成人结、直肠癌,乳腺癌,卵巢癌等恶性肿瘤的临床实验研究,取得了一定的治疗效果。本文拟对EpCAM的表达与HB的临床病理参数及临床意义进行研究,并通过动物实验,探讨EpCAM单克隆抗体靶向治疗的可行性。第一部分Ep CAM在小儿HB的表达及其临床意义目的:免疫组化染色检测Ep CAM在小儿HB中的表达,探讨其表达与HB各临床病理参数的关系及其意义。方法:回顾性分析上海交通大学附属儿童医院2010.01-2015.11期间收治的病理证实为HB的患儿共31例,其中随访资料完整共26例。采用Elivision两步法免疫组化技术检测26例HB肿瘤组织Ep CAM蛋白的表达情况,并探讨Ep CAM的表达与HB患儿年龄、性别、PRETEXT分期、AFP水平、病理类型等参数的关系。计量资料采用χ检验,计数资料采用t检验,Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,应用breslow进行差异性检验,所有统计学分析均采用SPSS22软件进行。结果:1.26例HB患儿,男19例,女7例,年龄6-108月(中位年龄27.2月)。所有患儿采用PRETEXT分期方法进行分期,其中Ⅰ期3例,Ⅱ期5例,Ⅲ期13例,Ⅳ期5例。术前AFP>1000ng/ml共22例,细胞膜,部分弥散至胞浆。***Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期HB患儿的3年总生存率(overall survival rate,OS)分别:66.7±2.72%,80±17.9%,42.3±16.5%,60±21.9%。Ep CAM阳性患儿和阴性患儿3年OS为分别48.4%和80%(P0.05)。结论:Ep CAM在大部分HB中均有表达,其表达与患儿的年龄、性别、肿瘤分期、病理类型无明显相关性,但Ep CAM阴性患儿3年OS显著高于Ep CAM阳性患儿。表明Ep CAM的表达与其HB患儿的预后有一定的相关性,可成为小儿HB的肿瘤标志物之一,并有可能成为HB靶向治疗的潜在靶点之一。第二部分Ep CAM单克隆抗体HB靶向治疗的实验研究目的:观察Ep CAM单克隆抗体对人HB肿瘤细胞裸鼠动物模型靶向治疗的疗效。方法:1.体外培养小儿HB Hu H-6细胞,免疫组化检测Hu H-6细胞的Ep CAM表达。2.在10只裸鼠皮下接种Hu H-6细胞,建立稳定的Hu H-6细胞荷瘤鼠模型后。将荷瘤鼠随机分二组:组1为实验组,经鼠尾静脉注射Ep CAM单克隆抗体(购自abcam公司),剂量30ug/kg,每天1次。组2为对照组,经鼠尾静脉注射等量生理盐水。干预3周后停药,取肿瘤组织进行病理切片检查,并通过免疫组化染色检测移植瘤Ep CAM的表达。通过测量移植瘤体积、重量,计算抑瘤率。结果:*** H-6细胞系传代培养成功,镜下可见肿瘤细胞呈梭形,大小一致,细胞核大,核深染。免疫组化染色检查可见Ep CAM阳性肿瘤细胞膜呈棕黄色颗粒。2.接种Hu H-6细胞4周后,裸鼠皮下即可出现肿块;6周时肿块直径可增大至4-5mm。此时进行干预实验,3周后取裸鼠皮下肿瘤组织,病理切片检查证实为HB。3.与对照组相比,Ep CAM单克隆抗体能明显抑制试验组裸鼠移植瘤的生长,表现为肿瘤体积明显缩小(1.12±0.09cm vs 1.37±0.77 cm,p=0.002),瘤体重量减轻(35.6±2.97mg vs 45.8±4.59mg,p=0.003)。Ep CAM单克隆抗体抑瘤率达22%。结论:动物实验结果表明,Ep CAM单克隆抗体能够抑制HB荷瘤鼠肿瘤的生长,表明其对小儿HB有潜在的靶向治疗作用;为Ep CAM单克隆

关键词：肝母细胞瘤上皮细胞粘附分子免疫组织化学裸鼠单克隆抗体靶向治疗

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非小细胞肺癌患者术后辅助治疗期间外周血循环肿瘤细胞EpCAM表达水平监测的临床意义

非小细胞肺癌患者术后辅助治疗期间外周血循环肿瘤细胞EpCAM表达...

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作者：真德智北京市结核病胸部肿瘤研究所

学位级别：硕士

研究背景:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌约占肺癌发病率的85%,治疗方法主要是手术完全性切除联合术后辅助放化疗,对辅助治疗效果监测仍依赖影像学,但是当影像学发现复发或转移灶... 详细信息

研究背景:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌约占肺癌发病率的85%,治疗方法主要是手术完全性切除联合术后辅助放化疗,对辅助治疗效果监测仍依赖影像学,但是当影像学发现复发或转移灶时即已达到Ⅳ期,对于Ⅳ期患者几乎没有有效治疗方法,5年生存率甚至不足2%。因此急需能够用于术后辅助治疗效果监测的早期指标。循环肿瘤细胞作为转移灶形成前关键过程已被大家公认,并且有研究表明循环肿瘤细胞具有早期诊断意义,因此我们提出假设:外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平可以作为非小细胞肺癌术后辅助治疗效果监测的早期指标。研究方法:应用本实验室前期建立的上皮细胞粘附分子Taq Man探针实时荧光定量PCR方法对非小细胞肺癌患者术后辅助治疗期间外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平进行监测,以影像学诊断复发或转移为随访终点,观察复发组与未复发组间外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平差异,初步探索非小细胞肺癌患者术后辅助治疗期间外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平变化与辅助治疗效果的关系。研究结果:2013年1月至2014年6月在首都医科大学附属北京胸科医院胸外二科就诊非小细胞肺癌患者共入组76例,有23例复发或转移(复发组);53例未复发或转移(未复发组)。复发组与未复发组第4次化疗给药前1天的外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平分别为5269.73±2356.39个拷贝/2ml和3625.51±1790.39个拷贝/2ml,两者比较具有统计学意义(p=0.008)。术后外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平监测平均时间为3.25个月,影像学诊断复发或转移平均时间为8.00±4.91个月,两者比较有明显统计学差异(p细胞Ep CAM表达水平比较差异有统计学意义,但是术后辅助治疗期间各监测时间点复发组外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平均高于未复发组,而且从第2次化疗给药前1天开始复发组外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平成持续上升趋势、未复发组呈持续下降趋势。研究结论:非小细胞肺癌术后外周血循环肿瘤细胞Ep CAM表达水平可以作为非小细胞肺癌手术患者术后辅助治疗期间疗效监测的早期指标。

关键词：非小细胞肺癌辅助治疗循环肿瘤细胞上皮细胞粘附分子疗效监测

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靶向EpCAM的嵌合抗原受体修饰的T细胞的构建及其对结肠癌细胞的杀伤研究

靶向EpCAM的嵌合抗原受体修饰的T细胞的构建及其对结肠癌细胞的杀...

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作者：文萍成都医学院

学位级别：硕士

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)是将识别肿瘤抗原的抗体分子和T细胞活化信号耦合的融合分子。经CAR修饰的T细胞将单克隆抗体的精确靶向特异性与细胞毒性T细胞的强毒性和持久性相结合,能够特异性识别肿瘤相关抗原而不依赖... 详细信息

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)是将识别肿瘤抗原的抗体分子和T细胞活化信号耦合的融合分子。经CAR修饰的T细胞将单克隆抗体的精确靶向特异性与细胞毒性T细胞的强毒性和持久性相结合,能够特异性识别肿瘤相关抗原而不依赖MHC限制,从而高效持久地杀伤肿瘤细胞。迄今为止,CAR T细胞免疫治疗已经在血液恶性肿瘤的临床治疗中取得了显著的疗效,但对实体肿瘤的治疗并未取得突破性进展。究其原因可能和实体肿瘤组织表面高度特异性肿瘤抗原的缺失有关。一个理想的靶抗原应当在肿瘤组织表面高表达,在正常组织不表达或低表达。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的干细胞标志之一,在肿瘤组织高表达,在正常组织仅在基底膜外侧表达。本研究中,我们以EpCAM为靶点,构建靶向EpCAM的CAR T细胞,探究靶向EpCAM的CAR T细胞对EpCAM+结肠癌细胞的杀伤能力。目的本课题以EpCAM为研究靶点,构建稳定表达EpCAM-CAR基因的T细胞,探究靶向EpCAM的CAR T细胞对EpCAM+结肠癌细胞的杀伤能力。材料与方法(1)转化、鉴定、扩增pCLK-EF-1 kana EpCAM-CAR,psPAX2、pMD2.G这三个病毒包装质粒;(2)利用磷酸钙法转染293T细胞以制备重组慢病毒颗粒,超高速离心以浓缩重组慢病毒颗粒,实时荧光定量PCR法检测重组慢病毒的滴度;(3)利用免疫蛋白印迹法和流式细胞术检测EpCAM在五种结肠癌细胞株(SW620、SW480、HCT116、LoVo、HT-29)中的表达;(4)人外周血单核细胞的提取及T细胞的活化、培养;(5)用携带EpCAM-CAR基因表达框的重组慢病毒颗粒转染人T淋巴细胞;(6)利用免疫蛋白印迹法、定量PCR法及流式细胞术检测转染后T细胞中CAR的表达;利用流式细胞术检测转染后中央记忆型T细胞的比例;(7)以携带epcam-car基因的t细胞为实验组效应细胞,以未转染的t细胞为对照组效应细胞,与epcam高表达的结肠癌细胞sw620按0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1的效靶比共培养,与结肠癌细胞sw480、hct116、lovo、ht-29按16:1的效靶比共培养。通过乳酸脱氢酶释放实验检测cart细胞对结肠癌细胞的杀伤能力;(8)以携带epcam-car基因的t细胞为实验组效应细胞,以未转染的t细胞为对照组效应细胞,与epcam高表达的结肠癌细胞sw620按0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1的效靶比共培养,与结肠癌细胞sw480、hct116、lovo、ht-29按16:1的效靶比共培养。利用酶联免疫吸附法检测cart细胞释放炎性细胞因子的水平。结果(1)成功转化、扩增pclk-ef-1kanaepcam-car、pspax2、pmd2.g这三个质粒;(2)成功包装携带epcam-car基因表达框的慢病毒;(3)结肠癌细胞行免疫蛋白印迹及流式细胞术结果显示:结肠癌细胞株sw620、sw480、hct116、lovo、ht-29表面epcam的阳性表达率分别为97.5%、85.4%、78.3%、75.4%、67.3%;(4)成功分离、激活t淋巴细胞,并大量增殖;(5)携带epcam-car基因表达框的慢病毒转染t淋巴细胞,rt-pcr和wb检测显示;转染后t细胞中存在epcam-car的表达;流式细胞术检测显示:转染后t细胞表面epcam-car的表达为50.4%;(6)与对照组相比,转染后的t细胞组,中央记忆型t细胞的比例增多;(7)实验组和对照组t细胞与五种结肠癌细胞共培养后行乳酸脱氢酶释放实验检测epcam-cart细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,结果显示:epcam-cart细胞对epcam+结肠癌细胞发挥杀伤作用,杀伤能力随着效靶比及肿瘤细胞表面epcam表达升高而逐渐增强;(8)实验组和对照组t细胞与五种结肠癌细共培养后行酶联免疫吸附实验检测细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-6)的释放水平,结果显示:与对照组相比,实验组T细胞炎性细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-6)的分泌水平更高,其分泌水平随着效靶比及肿瘤细胞表面EpCAM表达升高而逐渐升高。结论1.成功构建靶向EpCAM的CAR T细胞;2.靶向EpCAM的CAR T细胞可以识别并杀伤EpCAM+的结肠癌细胞;*** T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力依赖于CAR T细胞的数量和肿瘤细胞表面EpCAM的表达

关键词：嵌合抗原受体修饰的T细胞上皮细胞粘附分子结肠癌细胞杀伤

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食管鳞状细胞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测和临床意义

食管鳞状细胞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测和临床意义

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作者：高飞飞河北医科大学

学位级别：硕士

目的：食管癌是一种常见的消化道肿瘤，5年生存率低，预后较差，有许多食管癌患者死于肿瘤的远处转移。血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）是导致食管癌术后复发和远处转移的首要条件,因此，检测循环肿瘤细胞对判断... 详细信息

目的：食管癌是一种常见的消化道肿瘤，5年生存率低，预后较差，有许多食管癌患者死于肿瘤的远处转移。血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）是导致食管癌术后复发和远处转移的首要条件,因此，检测循环肿瘤细胞对判断食管癌的复发、转移及指导临床治疗上具有重要意义。上皮细胞粘附分子（epithelial cellular adhesion molecule，EP-CAM）是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间粘附的细胞表面跨膜蛋白，在上皮来源的细胞及上皮来源的肿瘤细胞中广泛表达，在细胞间信号传递、周期调控、粘附、增殖、分化及器官形态形成和维持等方面发挥着重要作用，与肿瘤的发生、发展、转移关系密切。本实验应用淋巴细胞分离法联合流式细胞技术（flow cytometry，FCM）检测食管癌患者血液中EP-CAM阳性循环肿瘤细胞的数量，采用免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）方法鉴定细胞是否为肿瘤细胞，本研究目的在于探讨EP-CAM阳性循环肿瘤细胞在食管鳞癌患者手术前后、化疗前后血液中的表达差异及其表达与临床病理学特征的关系，从而探讨其检测的临床意义。方法：30例食管鳞癌手术患者来自河北省人民医院胸外科、河北医科大学第四医院胸外科，2010年9月-2011年5月的食管癌患者（病理证实均为鳞状细胞癌），于术前1天和术后1小时、10天采新鲜静脉血5ml;30例食管鳞癌非手术患者来自河北省人民医院胸外科、肿瘤科，2010年9-2011年5月的食管癌患者（病理证实均为鳞状细胞癌），于化疗前1天和化疗5天后采新鲜静脉血5ml。10例健康志愿者外周静脉血液做对照组。分离所有实验对象血液中的单个核细胞（peripheral blood monoclonalcells，PBMCs），经流式细胞仪检测血中CD45－Ep-CAM＋循环肿瘤细胞的表达情况，应用细胞角蛋白CK19通过免疫细胞化学方法鉴定细胞为肿瘤细胞。分别测量上述所有入组实验对象外周血中CD45－Ep-CAM＋循环肿瘤细胞的表达情况，分析EP-CAM阳性循环肿瘤细胞在食管鳞癌患者手术前后、化疗前后血液中的表达差异及其表达与临床病理学特征的关系。统计学方法：运用统计学软件SPSS13.0对数据进行统计处理，对相关数据进行t检验、X2检验、方差分析或秩和检验，计算P值，以α=0.05为差异显著性标准，以P值＜0.05判断差异有统计学意义。结果： 1健康志愿者和食管鳞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测情况：应用流式细胞术可以检测到食管鳞癌患者外周血中EP-CAM阳性循环肿瘤细胞，但是细胞数量较少。免疫细胞化学染色显示循环肿瘤细胞胞质呈棕黄色深染。10例健康志愿者血液中没有检测到EP-CAM阳性细胞，60例术前和化疗前食管鳞癌患者有5例未检测到EP-CAM阳性细胞，与对照组表达差异具有统计学意义（X2=37.507，P=0.000）。 2食管鳞癌患者手术前、手术后1小时和手术后10天外周血中循环肿瘤细胞的检测情况：三组间Ep-CAM阳性循环肿瘤细胞的数量存在统计学差异（F=21.573，P=0.000），表达的数量平均值分别为：12.067±6.943（手术前）、12.100±6.630（手术后1小时）和8.433±4.576（手术后10天），三组间手术前和手术后1小时没有统计学差别（P=0.983），手术前和手术后10天有统计学差别（P=0.024），手术后1小时和手术后10天有统计学差别（P=0.023）。 3食管鳞癌患者化疗前、后外周血中循环肿瘤细胞的检测情况：两组间EP-CAM阳性循环肿瘤细胞的表达数量存在明显的差异，表达的数量平均值分别为：18.300±3.385（化疗后）和11.067±2.518（化疗后），两组间有统计学差异（t=19.366，P=0.000）;4手术前食管鳞癌患者外周血中EP-CAM阳性循环肿瘤细胞的数量和患者病理学特征之间的关系：根据患者术后的病理学特征进行分组，分析患者外周血中EP-CAM阳性循环肿瘤细胞的数量与肿瘤大小、浸润深度、是否淋巴结转移明显相关（P＜0.05），与肿瘤的分化无统计学相关（P＞0.005）。 5手术前食管鳞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的数量和肿瘤分期之间的关系：根据患者肿瘤分期进行分组，两组间EP-CAM阳性循环肿瘤细胞的表达数量存在明显的差异，表达的数量平均值分别为：7.938±6.126（Ⅱ期）和16.786±4.388（Ⅲ期），有统计学差异（Z=-3.655，P=0.000）。结论： 1通过Ep-CAM检测可以发现食管鳞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞。 2手术操作短期内不影响食管鳞癌患者循环肿瘤细胞的数量，

关键词：食管癌循环肿瘤细胞上皮细胞粘附分子免疫细胞化学流式细胞术

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