检索结果-南通市图书馆

生物工程学报 2020年第4期36卷 782-791页

作者：付妍张君轩付雪蓉解雨晨任泓宇刘佳陈修来刘立明江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(... 详细信息

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化,体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺,将3种酶在一株菌E. coli 3FT+L中共表达并实现上述配比,在30 L发酵罐中用E. coli 3FT+L全细胞转化12 h,L-ABA的产量为68.5 g/L,底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。

关键词： L-2-氨基丁酸三酶级联共表达重组菌全细胞转化 L-苏氨酸

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

三酶级联转化L-多巴高效生产D-丹参素

三酶级联转化L-多巴高效生产D-丹参素

引用

作者：杨家辉江南大学

学位级别：硕士

D-丹参素(Salvianolic acid,SAA)被广泛用于治疗心脑血管等疾病,具有多种药理学功效,如抗炎、抗肿瘤、抗衰老等,可以有效改善患者的健康状况。目前,D-丹参素的合成技术可分为化学法和酶转化法,前者的工艺复杂,生产成本昂贵且很难获得具... 详细信息

D-丹参素(Salvianolic acid,SAA)被广泛用于治疗心脑血管等疾病,具有多种药理学功效,如抗炎、抗肿瘤、抗衰老等,可以有效改善患者的健康状况。目前,D-丹参素的合成技术可分为化学法和酶转化法,前者的工艺复杂,生产成本昂贵且很难获得具有光学纯度的D-丹参素;相比之下,酶转化法的成本较低,但是底物的负载量少使得时空产率较低。因此,开发一种高效合成D-丹参素的工艺路线具有重要的意义。在本研究中,我们构建了一条以L-多巴(L-DOPA)为底物的三酶级联路径,在来源于变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶(PmLAAD)、来源于乳酸菌的苯丙酮酸还原酶(LaPPR)和来源于假丝酵母的甲酸脱氢酶(CbFDH)的催化作用下合成D-丹参素。通过蛋白质工程改造提升LaPPR的催化活性并对路径酶的表达水平进行优化,最终提高了该级联路径合成D-丹参素的效率。主要的研究结果如下:(1)D-丹参素合成路径的设计、构建和验证。首先,通过调研文献和分析酶数据库比较不同来源酶的活性,选择酶活性较高的来源于变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmLAAD(H295S/V437S)、来源于假丝酵母的甲酸脱氢酶(CbFDH)和来源于乳酸菌的苯丙酮酸还原酶(LaPPR)用于催化该级联反应,经体外纯酶催化的反应验证了该级联路径可以实现D-丹参素的合成,并进一步比较不同浓度的纯酶对产物生成速率的影响,确定了LaPPR为该级联反应的限速酶。(2)LaPPR的结构特征与催化机理。首先解析了LaPPR空蛋白的晶体结构,在晶体结构的基础上构建野生型LaPPR-NADH-DHPPA的对接模型并进行初步分析,推测了LaPPR的催化机理,根据LaPPR-NADH-DHPPA复合物MD模拟的计算结果及其代表性快照,表明催化过程中较长的氢化物转移距离d和质子转移距离d是LaPPR催化活性较低的关键因素。(3)蛋白质工程改造提高LaPPR的催化活性。通过分析催化机理及底物结合模式,设计突变体库,经过迭代饱和突变和组合突变获得了最优突变体LaPPR(H89M/H143D/P256C),其比活性和催化效率(K/k)相对于野生型分别提升了2.8倍和9.3倍。由MD模拟的计算结果,对比分析LaPPR-NADH-DHPPA和LaPPR-NADH-DHPPA复合物的代表性快照,发现突变后氢化物转移距离d和质子转移距离d分别从3.97(?)和4.12(?)缩短为3.51(?)和4.01(?),催化活性的构象数目占总构象的比例大幅度增加(由42/25000提升至610/25000),从而使LaPPR的催化活性提升。(4)三酶组装合成D-丹参素。将PmLAAD、LaPPR和CbFDH构建到同一菌株内,分别通过不同拷贝数质粒和RBS序列调控了三酶的体内酶活比例,得到最优菌株*** YJH11,此时三酶的体内酶活比例与体外最优酶活比例接近,最后优化了发酵产酶条件和转化条件,在最优条件的基础上,通过分批补料,最终将90 g·L L-多巴转化生成82.6 g·L D-丹参素,转化率为91.3%,ee>99%。

关键词： D-丹参素三酶级联全细胞生物转化蛋白质工程

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

酶法催化1,4-环己烷二甲醇合成1,4-环己烷二甲胺的研究

酶法催化1,4-环己烷二甲醇合成1,4-环己烷二甲胺的研究

引用

作者：韩业挺江南大学

学位级别：硕士

1,4-环己烷二甲胺(1,4-cyclohexanebismethylamine,1,4-BAC)作为重要的生物基材料单体,被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。目前其主要采用化学法生成,存在金属催化剂价格昂贵,反应条件苛刻和环境污染性大等问题,需寻... 详细信息

1,4-环己烷二甲胺(1,4-cyclohexanebismethylamine,1,4-BAC)作为重要的生物基材料单体,被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。目前其主要采用化学法生成,存在金属催化剂价格昂贵,反应条件苛刻和环境污染性大等问题,需寻找更绿色的合成方法替代。生物酶法具有反应条件温和、操作步骤简单、环境污染小、产品安全性高等优点,因而具有潜在的工业应用价值。本研究开发了一种通过级联醇脱氢酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶催化1,4-环己烷二甲醇生成1,4-环己烷二甲胺的生物转化体系。主要的研究结果如下:(1)1,4-环己烷二甲胺合成路径的设计、构建与验证:筛选到来自Escherichia coli的醇脱氢酶(YgjB)和转氨酶(YgjG)以及Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸脱氢酶(ScGlu-DH)作为路径酶,成功构建了级联转化1,4-环己烷二甲醇生成1,4-环己烷二甲胺的路径。然后,通过体外催化反应监测到产物的生成,经阳离子质谱鉴定证明了该路径的可行性;(2)蛋白质工程改造提高YgjG的催化活性:基于YgjG的底物结合模式以及相关文献的报道,发现位于底物结合口袋处的非保守氨基酸残基有F91、Q119*、F180、F327*和L419,对以上氨基酸残基进行饱和突变,通过高通量筛选得到最优突变体YgjG。酶学参数的测定发现YgjG的比酶活和k/K值与野生型相比分别提高了2.2倍和1.8倍。分子动力学模拟表明YgjG缩短了1,4-环己烷二甲醛与磷酸吡哆醛的复合物的碳原子与催化残基K300侧链的氮原子的距离,且能更好的稳定该复合物,从而使得k提高,催化效率得到提高;(3)三酶组装合成1,4-环己烷二甲胺:通过采用拷贝数不同的质粒组装三个路径酶,成功构建了16株工程菌,全细胞转化实验筛选得到最佳共表达菌株*** 09。通过核糖体结合位点(RBS)策略,优化了YgjB的表达水平得到菌株*** 23。并确定了***23的最佳产酶条件以及最佳转化条件。最终,综合上述最优条件在摇瓶水平生产产物1,4-环己烷二甲胺,产量为7.71 g·L,转化率78.2%。

关键词： 1,4-环己烷二甲胺转氨酶醇脱氢酶蛋白质工程三酶级联

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：