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HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立

HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法...

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作者：李相梅吉林大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(HPV)是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白(L1)能够自发组装成病毒样颗粒(VLP),其表面存在HPV的主要... 详细信息

人乳头瘤病毒(HPV)是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白(L1)能够自发组装成病毒样颗粒(VLP),其表面存在HPV的主要中和表位,具有高度的免疫原性,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以HPV L1 VLP为其主要抗原成分。由于疫苗的高成本、高售价是限制其在发展中国家应用的主要因素,所以研发出价格低廉的高价次HPV预防性疫苗具有重要意义。此外,佐剂也是影响疫苗免疫效果的一个关键因素。因此,本论文拟通过对HPV6 L1蛋白原核表达条件进行优化以提高其可溶性表达量,并进行佐剂筛选以提高疫苗的免疫原性,为HPV VLP预防性疫苗的研发提供实验数据。本研究首先构建了原核表达质粒pET30a(+)-6L1,通过对诱导剂的使用量、诱导温度及共表达分子伴侣等三方面进行优化,确定最佳表达条件;之后选择Al(OH)、AlPO和Nano Al三种佐剂与HPV6 L1 VLP共同免疫,采用ELISA和中和试验进行免疫原性评价。结果显示:(1)适当降低蛋白合成速度能够增加目的蛋白可溶性表达量,当诱导剂IPTG使用终浓度为0.1mM、诱导温度为25℃时,HPV6 L1蛋白可溶性表达量更高;(2)分子伴侣TF对HPV6 L1蛋白可溶性表达的增强效果更佳;(3)四组疫苗均能提供较好的、较为持久的保护作用,其中Al(OH)佐剂组中和抗体水平明显高于其他佐剂组。免疫原性评价是HPV疫苗临床研究中的重要内容,但传统的中和抗体检测方法操作繁琐。当前国内外通用的HPV假病毒中和抗体检测方法是使用携带EGFP的假病毒,这就导致在进行九价免疫血清检测时,需通过九次单独试验,操作复杂且耗时长。本研究是在原有的基础上,选择三种激发、发射波长互不干扰的荧光蛋白EGFP、mTagBFP2、mRFP,用不同型别的假病毒包裹不同颜色的荧光蛋白基因,制备三种单色荧光假病毒PsV6G、PsV16B、PsV52R。通过分别使用单色荧光和三色混合荧光假病毒检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和抗体水平,以验证三色混合荧光假病毒检测系统的准确性。结果显示:(1)单色荧光、三色混合荧光假病毒检测试验的板内变异系数(CV)小于10%,板间变异系数(CV)小于20%,说明试验重复性较好;(2)单色荧光与三色混合荧光假病毒检测中和抗体滴度值无统计学差异(P>0.05),说明两种检测方法具有一致性,且三色混合荧光假病毒检测免疫血清不存在干扰现象。本研究的结果表明,三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法能够应用于HPV九价免疫血清中和抗体的检测,这为一种基于荧光信号的高通量HPV假病毒中和抗体检测方法的建立提供了新思路,为高效、快速地检测HPV九价疫苗临床血清奠定了坚实基础。

关键词：人乳头瘤病毒分子伴侣佐剂三色混合荧光假病毒中和抗体

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